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1、第35卷第1期工业微生物Vol.35No.12005年3月IndustrialMicrobiologyMar.2005NAD(P)依赖型氧化还原酶分离纯化技术进展3徐小琳, 徐 岩, 穆晓清(江南大学生物工程学院,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡214036)摘 要NAD(P)依赖型的氧化还原酶是一类重要的生物催化剂,在生物合成中被广泛应用。以亲和技术为基础的分离纯化方法与其它分离制备方法相比具有高选择性、高活力回收等优点。本文着重讨论亲和色谱技术在NAD(P)依赖型的氧化还原酶的分离纯化及制备中的研究进展。关键词:NAD(P)依赖型氧化还原酶; 分离纯化; 亲和色谱NAD(P)依
2、赖型的氧化还原酶(EC1.1.1)包括丧失,在参与催化反应时必须重新加入所需辅酶。一大类催化生物氧化还原反应的酶,其催化反应需辅酶对于氧化还原酶不仅是参与转移质子的作用,要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺对于稳定酶的三维构象维持酶的稳定性也有重要作嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的参与,辅酶以可溶性用。在纯化过程中,辅酶的丢失常常是不可避免的,组分存在于酶结构之中。化学及生物化学的很多转酶的活力也因此受到影响,另外空气氧化、金属离子化过程都涉及氧化还原反应,开发有实际应用价值抑制等因素也会影响氧化还原酶的稳定性。如何维的氧化还原酶是生物技术领域一直以来的一项重要持酶的稳定性,阻止
3、或减缓酶的失活,是在分离纯化内容。在过去的几年中,以氧化还原酶为基础的临过程必须重点考虑的问题。影响生化产品价格诸因床诊断,生物感应器,再生辅酶系统,手性化合物的素中,首当其冲的是分离与纯化过程,其费用通常占生物合成以及污染物生物降解等技术都取得了令人生产成本的50%～70%,有的甚至高达90%。分离[1,2]瞩目的进展。氧化还原酶被用于不对称合成功步骤多、耗时长,往往成为制约生产的“瓶颈”。寻求能性类固醇、手性药物制剂、合成或修饰聚合物、氧经济适用的分离纯化技术,已成为生物化工领域的[5]化羟基及构建生物感应器等各个方面。其中NAD热点。酶的纯化已经进行了近百年的发展,已有(P)依赖型
4、氧化还原酶在手性合成中有着重要的作很多现成程式来进行纯化工作,对于所有的纯化过用。如脱氢酶催化醛、酮、羰基以及烯烃碳碳双键的程来说,尤其是生物活性物质的纯化,快速纯化是成还原,使许多潜手性物质转化为手性产品应用于医功的关键。实验室分离纯化NAD(P)依赖型氧化还[3,4]药、食品、精细化工等领域。NAD(P)依赖型的原酶的方法,几乎都涉及到不同的色谱分离技术,其氧化还原酶来源十分广泛,在自然界中普遍存在,从中92%用到亲和色谱,79%的实验同时使用离子交动物、植物和微生物中已经分离出274种不同的换色谱,分子排阻64%,疏水色谱24%,变性电泳NAD(P)依赖型的氧化还原酶(Protei
5、nDataBankSDS2PAGE92%,非变性电泳48%,等电聚焦[6]summery简称PDBsum)。由于与动植物比较,微生14%。本文介绍了一些常用的分离方法、亲和色物种类众多,易于获得,生长周期短,产率高,且来源谱、以及大规模分离的方法。于微生物的酶,有着特殊的立体选择性,因此新的1 分离纯化方法NAD(P)依赖型的氧化还原酶的筛选、纯化工作很多都集中在来源于微生物的酶中。 按目的不同,选择分离方法也有一定差异。一 氧化还原酶所需辅酶与酶的结合不是很紧密,般分两类:一是以分析为目的,获取尽可能高纯度酶在透析过程中会失去,失去辅酶的氧化还原酶活性供生化分析;另以制备为目的,要
6、求获得尽可能多的基金项目:江苏省高技术研究计划资助项目(编号:BG2002320);山东大学微生物技术国家重点实验室开放课题作者简介:徐小琳(1976～),女,硕士,讲师。3责任作者。—49—©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved. 第1期工 业 微 生 物第35卷 酶,而只需一定纯度。利用各种色谱方法除去大多杂蛋白,得到较纯的酶;1.1 分析为目的的分离纯化最后利用电泳方法进一步纯化或作为目的产品纯度[6]1.1.1常用分离方法的鉴定。其中色谱分离方法是获得纯酶的关键 尽管来源不同的NAD(P)依赖
7、型氧化还原酶在步骤。常用的色谱分离方法有离子交换色谱、凝胶结构和功能上不完全相同,但许多分离纯化的方案色谱及疏水色谱。色谱法主要是基于酶蛋白的理化类似。NAD(P)依赖型的氧化还原酶的一般纯化方性质设计的。它们对NAD(P)依赖型氧化还原酶的案(如图1所示)一般分为三大步骤:首先从细胞中选择性并不是很高,但通过适当组合,也可分离出电提取粗酶,将目的酶尽可能抽提出来溶解于水相中,泳级纯度的酶。如表1所示,不同分离方法的组合,+[7]通
