红海榄脱水素基因(RsDHN1)克隆及表达分析

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1、第31卷第5期热带作物学报V0】．3lNo．52010年5月CHINESEJOURNALOFTROPICALCROPSMay．2010红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析马宏伟，徐远峰，翟金玲，陈旭峰，黄惜霉海繁南大学蒂生物科擎学磊技术研究所海碍南海碍口，570228摘要采用RT—PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆．通过Blast分析和序列比对可知，该基因全长cDNA序列包括146bp的5端非编码区，43bp的3端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框．命名为RsDHN1基因该cD

2、NA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构，属于SKn类脱水索蛋白．与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43％55的氨基酸序列同源性。半定量RT—PCR分析表明。盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用关键词红海榄；脱水素：RACE；耐盐基因doi10．3969~．issn．1000—2561．2010．05．020中图分类号Q785．978620世纪以来，世界人El迅速膨胀，耕地面积由于盐碱化、全球气候变暖、沙漠化及工业区域扩展、城镇建设加快等因素而快速减少．使有限的耕地与水资源面临一场新的危机。中国目前有未开发的盐碱化土壤5

3、．2亿亩．这些盐碱地是人类未来潜在的耕地。目前，人类耕种的绝大部分作物都缺少耐盐性，探索植物耐盐机制．提高植物耐盐性，开展耐盐作物分子育种，对减轻人类所面临的土地资源、淡水资源、粮食供需的矛盾以及有效控制环境恶化具有重要的战略意义l】1自然界经过长期仁存竞争．自然选择和优胜劣汰．存留下大量耐盐植物资源．这些耐盐植物是开展植物耐盐机制研究的重要材料和基因库资源。红树林植物长期生长在高盐、高渗透压下的海水环境中，已进化出一套有别于陆生植物或淡水生植物的耐盐机制，属于真正的盐生植物l2l。红海榄(Rhizophorastylosa)是这类

4、植物中比较典型的一种，它属于红树科(Rhizophorace)红树属(Rhiz0ph0ra)，耐盐优势明显，是研究植物耐盐机制的理想材料[31。为了克隆红海榄的耐盐相关基因．笔者在前期试验中构建了红海榄cDNA文库，将红海榄幼苗分别进行淡栽和盐栽处理。通过基因芯片分析在其根部差异表达基因，找到了一些有明显差异表达的cDNA片段。本文采用RT—PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了其中一个差异表达片段的全长cDNA序列．通过Blast分析和序列比对．将之鉴定为脱水素基因，命名为RsDHN1：用半定量RT—PCT分析盐胁迫对

5、其表达的影响．为进一步研究该基因的功能和鉴定红海榄的耐盐机制奠定基础。1材料与方法1．1材料红海榄(Rhizophorastylosa)，采自海南东寨港红树林保护区。菌种EscherichiacoliDH5a本实验室保存。SuperscriptTMcDNA第一链合成试剂盒购自Invitrogen公司；TaKaRaLAPCRTMKitVer．2．1购自大连宝生物有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、DNA聚合酶等购自TIANGEN公司；T4一DNA连接酶、限制性内切酶等分子生物学试剂购自Fermentas公司：其它生化试剂为国产分析纯。引物

6、合成和DNA测序资助项目：人力资源与社会保障部2008年度高层次留学人才回国工作资助项目，海南大学2009年度科研项目(hd09xm60)，海南自然科学基金项目(808109)资助。第一作者简介：马宏伟，男，1984年生，山西人，硕士研究生。研究方向：作物遗传育种。E-mail：a123tianma@163．con。通讯作者，黄惜，E-mail：xihuangO1@gmail．corn；Tel：0898—66279271。收稿13期：2010—03—15修回日期：2010—04—215期马宏伟等：红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克

7、隆及表达分析805均由上海生工生物技术有限服务公司(简称上海生工)负责完成。eDNA合成CDSm／3PCRPrimer：5一ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG—d(T)30N．1N一3(N=A、G、C或T；N．1=A、G或C)，SMARTIVOligo(dT)：5一AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGC-CATTACGGCCGGG一3。特异弓I物，5RACE，RsDHN5"out：5一GGAGCGGCTI"GATCTY一3：RsDHN5in：5一TGTCCTCCTGGCAGTF一3。1．2方法1．2

8、_1红海榄叶片总RNA的提取采用改良的CTAB法提取红海榄叶片总RNA在液氮下研磨叶片．取约5g叶片粉末加到预先预热的15mL提取缓冲液中，再加入15mL体积比为25：24：1的苯酚：氯仿：异戊醇，充分混匀，冰浴15min；4℃下12