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1、!248!解放军预防医学杂志2010年8月第28卷第4期JPrevMedChinPLAAugust2010Vol.28No.4氯霉素竞争ELISA检测试剂盒的研制*杨丽丽,胡红芳,高志贤(军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)摘要:目的应用抗氯霉素多克隆抗体,建立竞争ELISA分析方法,研制氯霉素残留快速检测试剂盒,并对其性能进行测定。方法选用抗氯霉素高特异性抗体,直接包被抗体后,将酶标记氯霉素和氯霉素标准品或样品加入预先包被了特异性抗体的孔内,建立直接竞争ELISA检测试剂盒。结果所选用的抗体对氯霉素亲和力高,与链霉素
2、、四环素、土霉素、青霉素4种抗生素及克伦特罗的交叉反应率均小于0.01%;抗体的特异性强;检测质量浓度为50、10.5、0.5mg/ml样2本时,平均变异系数为11.4%;对氯霉素残留检测的标准曲线为y=-14.843logx+56.692,R=0.9965,线性范围为0.02~64.0ng/ml,检测限IC10为0.451ng/ml,灵敏度IC50为2.82ng/ml,样品的加标回收率为72%~113%。结论试剂盒检测的准确性和重现性较好,可用于批量虾肉、鸡肉、牛奶等样品中氯霉素残留的检测。关键词:氯霉素;酶联免疫吸附分析;试剂盒
3、中图分类号:R978.13文献标志码:A文章编号:1001-5248(2010)04-0248-057随着经济的发展,人们的生活质量日益提高,对选。本文选用抗氯霉素高特异抗体,采用直接包食品卫生安全问题更加重视。食品中药物残留问题被抗体的方法建立直接竞争ELISA法构建氯霉素残是食品卫生安全问题之一。氯霉素(Chlorampheni留检测试剂盒,确定了该法用于检测氯霉素的低限,8col,CAP)是一种应用广泛的广谱抗生素,对多种病并对试剂盒的各个性能进行测定。该试剂盒具有1原菌具有较强的抑制作用。但由于氯霉素存在严灵敏度
4、高、特异性强、简单快速等优点,在实际样品重的毒副作用,其在动物的肉、奶、蛋中的残留,威胁的检测中,重现性好,变异系数小,可用于样品残留着人类的健康。目前,许多国家严格规定了氯霉素量的检测。2的残留限量,美国,芬兰规定了畜禽、水产中CAP1材料与方法的最高残留限量为0,欧共体规定为10g/kg,我国规定为2g/kg。目前,氯霉素残留分析主要采用高1.1材料与仪器3456效液相色谱法和气相色谱法。高效液相色1.1.1材料与试剂酶标仪(Thermo,USA),虾肉、谱法操作简单,但检出限较高,无法满足当前对氯霉牛奶、鸡肉从天津市各超
5、市随机抽取,抗CAP多克素低残留限量的要求;气相色谱法灵敏度较高,但样隆抗体为本实验室制备并保存,氯霉素标准品为品前处理过程复杂,而且仪器价格昂贵,不适合在基AMERSCO公司分装产品,辣根过氧化物酶为美国层推广使用。Sigma公司产品,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自天免疫分析方法作为一种特殊的分析技术,近几津华生生物公司,意大利Euroclone氯霉素ELISA快年来在兽药、农药等小分子化合物的残留分析中应速检测试剂盒购自北京中检维康技术公司,其他试用越来越广泛。酶免疫测定法检测时间短,不需要剂均为分析纯。复杂的仪器设备,特异性强、灵敏度高、
6、试样预处理1.1.2缓冲溶液系统(1)包被缓冲液:0.2mol/L简单,非常适合在现场和基层对氯霉素残留进行筛pH9.6碳酸盐缓冲液;(2)稀释缓冲液:0.01mol/LpH7.4PBS溶液;(3)洗涤缓冲液:0.01mol/LPBST;作者简介:杨丽丽(1983-),女,硕士研究生。从事食品安全检测研(4)TMB底物溶液:A液(四甲基联苯胺200mg溶于究。作者现单位:华中农业大学食品科技学院无水乙醇100ml),B液为0.2mol/LNa2HPO4,0.1*通讯作者:gaozhx@163.cmmol/L柠檬酸溶液,pH5.0,C液为0.75
7、%过氧化氢解放军预防医学杂志2010年8月第28卷第4期JPrevMedChinPLAAugust2010Vol.28No.4!249!尿素,将A液0.5ml、B液9.5ml、C液42l按比例ELISA方法的检测限。混合,即为TMB溶液;(5)终止液:2mol/LH2SO4溶1.2.4在抗体的特异性优化条件下,将氯霉素标液。样、酶标抗原及其他类似物(琥珀氯霉素、链霉素、四1.2方法环素、土霉素和青霉素)做系列稀释,作标准曲线,并1.2.1酶标半抗原的制备以混合酸酐法合成酶在曲线上找出抑制率50%的剂量,以及类似物抑制标半抗原。将
8、氯霉素标准品溶解于二甲基亚砜率50%时的用量,计算各类似物的交叉反应率。(DMSO)后加入适量正三乙胺,搅拌反应后,加入氯
