氯霉素elisa检测试剂盒的研制及其性能测试

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1、中国食品学报第7卷第6期Vol.7No.62007年12月JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyDec.2007氯霉素ELISA检测试剂盒的研制及其性能测试郭逸蓉桂文君王姝婷朱国念(浙江大学农药与环境毒理研究所杭州310029)摘要采用包被多克隆抗体直接竞争ELISA法建立了氯霉素残留的酶联免疫分析方法,并构建了氯霉素残留ELISA检测试剂盒。研究结果表明,所选用的抗体对氯霉素亲合力强、特异性高,试剂盒对氯霉素残留检测的线性范围为0.24~250ng/mL,检测限(IC10)0.47ng/mL,样品的

2、加标回收率70%~130%。试剂盒性能测试结果表明,其准确性和重现性较好,保存期至少6个月,可用于虾肉、鸡肉、蜂蜜、鲜奶样品中氯霉素残留的批量快速、廉价检测。关键词氯霉素酶联免疫吸附分析试剂盒文章编号1009-7848(2007)06-0118-06氯霉素(chloramphenicol,CAP)是第一个采用本文选用抗氯霉素琥珀酸单酯(CAP-HS1)多化学合成法生产的抗生素,对多种病原菌具有较克隆抗体,采用包被抗体-酶标半抗原直接竞争强的抑制作用。由于其效高价廉,曾被广泛应用于ELISA法构建氯霉素残留酶联免疫检测试剂盒,各类家禽、家畜、蜜蜂和水产品的各种传染病

3、的防并与国内外同类商用试剂盒进行了性能对比试验。治。然而,氯霉素存在着严重的毒副作用,能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺症以及新生1材料与方法儿、早产儿灰色综合症等,对人类健康构成巨大的1.1材料与仪器潜在威胁[1～2]。因此,氯霉素残留问题已引起国际组1.1.1材料与试剂99.1%氯霉素标准品,浙江大织和许多国家及地区的高度重视。近年来欧盟、美学动物科学学院提供;99.4%甲砜霉素标准品,浙国等发达国家已相继禁止氯霉素用于动物源性食江润康药业有限公司;氟甲砜霉素标样、四环素标品,并明确规定氯霉素残留限量为不得检出[3～4]。 样、磺胺二甲嘧啶标样、盐酸克伦特

4、罗标样,浙江目前,国外采用商品化的氯霉素试剂盒,直接省疾病预防控制中心;辣根过氧化物酶(HRP),竞争酶联免疫法检测氯霉素。该法灵敏度高、操作华美生物工程公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF),方便。国内对氯霉素残留快速检测技术的研究相杭州双林化工试剂厂;正三丁胺,上海业联联合化对滞后,大多停留在间接竞争ELISA法,仅少数采 工有限公司;氯甲酸乙酯,上海同济微量元素研究用包被羊抗兔IgG抗体(二抗)的直接竞争ELISA 所;乙酸乙酯,杭州余杭高晶精细化工有限公司;法[5]。普遍使用的试剂盒主要为德国r-Biopharm 正已烷,国药集团化学试剂有限公司;氯霉素半抗

5、公司、英国RANDOX公司及荷兰Euro-Diagnosti- 原CAP-HS1,由本实验室制备;碳酸盐缓冲溶液ca公司的产品[6],价格昂贵。国产氯霉素残留检测 (CBS,0.01mol/L、pH9.6);磷酸盐缓冲溶液(PBS,试剂盒的质量和性能不够稳定,市场化范围很小。0.01mol/L、pH7.4);洗涤液(PBST,含0.05%吐温-因此,研究具有我国自主知识产权的氯霉素残留20的PBS,pH7.4);底物溶液:每25mL0.05mol/快速检测技术很有必要。L、pH5.0～5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液,临用前加入10mg邻苯二胺(OPD),溶解后加

6、入10μL收稿日期:2006-12-28基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30370944)作者简介:郭逸蓉,女,1983年出生,硕士生通讯作者:朱国念30%H2O2,混匀待用;终止液:2mol/L硫酸。1.1.2仪器DEM-Ⅲ自动酶标洗板机,北京拓普分析仪器有限责任公司;氮气吹蒸装置,杭州雪中第7卷第6期氯霉素ELISA检测试剂盒的研制及其性能测试119炭恒温技术有限公司;MM-1型微量振荡器,江苏IC50和IC10。抑制率计算公式:省姜堰市康泰医疗器材厂;旋涡混合器WH-861,太仓市科教器材厂;酶标仪(680型),BIO-RAD公司;WHS型智能恒温

7、恒湿箱,宁波江南仪器厂;96孔聚苯乙烯酶标板,美国COSTAR。I=(ODmax-ODmin)-(ODi-ODmin)×100%(1)×100%(1)(ODmax-ODmin)式中:ODmax———不加药时的吸光值;ODi———氯霉素浓度为i时的吸光值;ODmin———空白对照的吸光值。以IC50来衡量抗体对氯霉素的亲合性,1.2方法以IC10为该ELISA方法的检测灵敏度指标。1.2.1氯霉素抗体的制备按照黄雅丽等人的方1.2.5抗体的特异性采用上述方法对氯霉素与 法[7]制备抗CAP-HS1多克隆抗体,经纯化后制成甲砜霉素、氟甲砜霉素、四环素、磺胺二甲嘧啶和

8、冻干粉。盐