应用SYBRGreenⅠ荧光PCR熔解曲线同时检测两种致病菌

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1、动物医学进展，２００９，３０（２）：１２１５ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ应用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光ＰＣＲ熔解曲线同时检测两种致病菌曹琛福，花群义，秦智锋，吕建强，曾少灵，陶虹，张彩虹，宗卉（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳５１８０１０）摘要：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ是一种特异结合双链ＤＮＡ的染料，已被证明能灵敏地检测核酸。采用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光ＰＣＲ熔解曲线，通过摸索、优化ＰＣＲ反应条件及反应体系，扩增出两条不同大小、Ｔｍ值不同的目的核酸片段，表现在熔解曲线上出

2、现两个独立的波峰，建立了用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光ＰＣＲ熔解曲线来检测多个基因的方法，从而实现不用核酸探针，简单、经济、快速的多重荧光ＰＣＲ方法检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌。关键词：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光ＰＣＲ；沙门菌；产单核细胞李斯特菌中图分类号：Ｓ８５２．６；Ｓ８５４．４３文献标识码：Ａ文章编号：１００７５０３８（２００９）０２００１２０４实时荧光定量ＰＣＲ的化学原理包括探针类和１材料与方法非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的１．１材料探针来指示扩增产物的增加，如犜犪狇Ｍａｎ探针和分沙门菌购自美

3、国菌种保藏中心（ＡＴＣＣ），编号子信标；非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计为ＡＴＣＣ１４０２８；产单核细胞李斯特菌购自ＡＴＣＣ，的引物来指示扩增的增加，如ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ和Ｌｕｘ编号为ＡＴＣＣ１９１１２；细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒引物。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更购自宝生物工程（大连）有限公司ＭｉｎｉＢＥＳＴＢａｃｔｅ高，但后者则简便易行且经济。在微生物检测过程ｒｉａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＤＶ８１０Ａ）；中，先采用简便、经济的方法进行初筛而后再分离鉴ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧

4、光ＰＣＲ混合液购自Ｓｉｇｍａ公司定是十分必要的，这样可以大量减少微生物检测的ＴＭＴＭＳＹＢＲＧｒｅｅｎＪｕｍｐＳｔａｒｔ犜犪狇ＲｅａｄｙＭｉｘｆｏｒ工作量及检测周期。因此，本试验的目的是采用荧ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（Ｓ１８１６）；采用罗氏荧光ＰＣＲ仪进光染料ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ建立多重荧光ＰＣＲ方法来同行荧光ＰＣＲ反应。时检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌。为采用免疫１．２细菌ＤＮＡ的提取磁珠方法一次富集多种目标菌后，提供快速、简单、按ＭｉｎｉＢＥＳＴＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃ经济的多重

5、荧光ＰＣＲ检测。ｔｉｏｎＫｉｔ操作说明书步骤进行细菌ＤＮＡ的抽提，其ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ是一种特异结合双链ＤＮＡ的染中在细菌裂解时另外添加了溶菌酶，以便细菌能较料，结合双链ＤＮＡ后荧光增强１０００倍左右，且对好的破碎裂解，特别是对于产单核细胞李斯特菌。［１］ＤＮＡ双链结构具有稳定作用，适合于检测ＰＣＲ提取完后－２０℃保存待用。扩增产物，能对ＰＣＲ扩增产物进行连续的监测。由１．３荧光ＰＣＲ引物于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ能结合于所有双链，因而不能特本试验沙门菌ｉｎｖＡ基因上游引物为５′ＴＣＡ异性地检测某一特定模板，但通过温

6、度的变化对扩ＴＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＣＣ３′，下游引物为增产物解链温度（Ｔｍ）的分析使多重反应成为可能。５′ＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＧＣ本文拟通过不同扩增产物Ｔｍ值的不同，表现在熔ＡＡ３′，扩增片段大小为２８４ｂｐ，Ｔｍ为８５．５℃。产解曲线上出现多个峰来区别不同的扩增产物，从而［２］单核细胞李斯特菌ｈｌｙＡ基因上游引物为５′实现多重荧光ＰＣＲ的检测。ＣＣＴＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡ３′，下游引物为收稿日期：２００８１１０４基金项目：深圳出入境检验检疫局科技项目（２０

7、０６ＳＺＫ０１）作者简介：曹琛福（１９７７－），男，江西南康人，硕士，主要从事动物及其产品检验检疫工作。曹琛福等：应用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光ＰＣＲ熔解曲线同时检测两种致病菌１３５′ＡＡＧＣＧＣＴＴＧＣＡＡＣＴＧＣＴＣ３′，扩增片段大菌上、下游引物各１μＬ及产单核细胞李斯特菌上、下小为７０２ｂｐ，Ｔｍ为８０．５℃。游引物原液各１。每管用无菌水补足１０，再μＬμＬ加入ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＪｕｍｐＳｔａｒｔＴＭＴＭ１．４荧光ＰＣＲ反应体系犜犪狇ＲｅａｄｙＭｉｘｆｏｒ本试验将不同模板、引物量分别加入７个罗氏Ｑｕａｎｔｉｔ

8、ａｔｉｖｅＰＣＲ混合液１０μＬ。荧光ＰＣＲ仪专用毛细管中进行荧光ＰＣＲ反应。其１．５荧光ＰＣＲ反应程序中１号管中加入１０倍稀释的沙门菌模板４μＬ，９４℃，５ｍｉｎ；９４℃，３０ｓ；６０℃，６０ｓ３５个循１０倍稀释沙门菌上、下游引物各１μＬ；２号管中加环；７２℃，５ｍｉｎ。入１０倍稀释的产单核细胞李斯特菌模板４μＬ，１０１．６熔解曲线反应程序倍稀