BJS 201707 植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定

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1、附件植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS2017071范围本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法。本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定。2原理提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有

2、该源性成分。3试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为：核桃5’端引物:5’-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3’核桃3’端引物:5’-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3’核桃探针：5’-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3’3.2花生源性成分Arab2基因检测用引物（对）序列为：花生5’端引物:5’-GCAACAGGA

3、GCAACAGTTCAAG-3’花生3’端引物:5’-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3’花生探针：5’-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3’3.3杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为：杏仁5’端引物:5’-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3’杏仁3’端引物:5’-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3’杏仁探针：5’-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC-Eclipse-3’3.4芝麻源性成分2Salb

4、umimmRNA基因检测用引物（对）序列为：芝麻5’端引物:5’-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3’—1——芝麻3’端引物:5’-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3’芝麻探针：5’-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC-TAMRA-3’3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为：榛子5’端引物:5’-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3’榛子3’端引物:5’-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3’榛子探针：5’-FAM-TCCCGTTCT

5、CGTCCCTGCGGT-Eclipse-3’3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为：大豆5’端引物:5’-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3’大豆3’端引物:5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3’大豆探针：5’-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-TAMRA-3’3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为：内参照5’端引物:5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’内参照3’端引物:5’-AATTTGCG

6、CGCCTGCTGCCTTCCTT-3’内参照探针：5’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-TAMRA-3’3.8CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB，1400mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min,备用。3.9蛋白酶K：20mg/mL。3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）。3.11异丙醇。3.1270%乙醇。3.13TaqDNA聚合酶。3.14dNTP

7、混合液。3.15TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。3.1610×PCR缓冲液：200mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2，200mmol/LTris-HCl（pH8.8）。4仪器和设备4.1组织研磨器。4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。4.3恒温水浴锅。4.4离心机：离心力12,000g。4.5微量移液器（0.5μL~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μ

8、L）。4.6实时荧光PCR仪。4.7涡旋振荡器。—2——4.8天平：感量0.01g。5分析步骤5.1试样总DNA的提取固体样品：将样品粉碎后称取0.3~0.6g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA。液体样品：取1mL样品于Eppordorf管中，加入1倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5min，室温下以12,500rpm离心5min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列