细菌内毒素检查技术培训班 讲 义

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1、细菌内毒素检查技术讲义北京毕特博生物技术有限责任公司2007年9月2007-9-101Bitab目录一、细菌内毒素检查的基础理论-------------3二、BET试验前的准备------------------------24三、细菌内毒素检查的实验技术-------------281，鲎试剂灵敏度复核-------------------------332，干扰初筛试验------------------------------403，干扰试验------------------------------------494，检查法---------------

2、------------------------62四、细菌内毒素检测技术的发展2007-9-102Bitab一、细菌内毒素检查的基础理论1，细菌内毒素2，鲎试剂3，BET用水4，BET程序5，2005年版细菌内毒素检查法6，相关参数的计算7，试验的相关知识2007-9-103Bitab1、细菌内毒素1）化学成分及特性--革兰氏阴性细菌细胞壁的产物--是高分子量脂多糖复合物（LPS）除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性致热性耐热性酸碱性与鲎试剂反应分子极性需要在250摄氏度干热至少30~60分钟才能彻底灭活多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性，在水中呈不均匀分布内

3、毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶与强酸强碱水解反应（1）特性2007-9-104Bitab内毒素的分子结构（2）化学结构--含有3个截然不同的区域◆O-特异侧链◆核心多糖◆类脂A2007-9-105Bitab2）内毒素与热原的关系--内毒素是热原之一种--医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。3）标准内毒素和环境内毒素1）标准内毒素经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET检查的参考品或对照品。主要分参考

4、标准品（RSE）及工作标准品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。2）环境内毒素天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。2007-9-106Bitab4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，其他国家药典都有类

5、似要求--具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布2007-9-107Bitab2、鲎试剂1）鲎试剂的分类--根据鲎的种类分类美洲鲎试剂(LAL)中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）--根据检查方法分类凝胶法鲎试剂光度法鲎试剂--根据鲎试剂的反应特异性分类普通鲎试剂特异型鲎试剂2007-9-108Bitab2）鲎试剂的规格--一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂）--把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂--多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。2

6、007-9-109Bitab3）鲎试剂的质量标准--灵敏度定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml--自身凝集部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应--缓冲能力--干燥失重--无菌：中国标准无此项要求2007-9-1010Bitab4）鲎试剂与内毒素的反应机理C因子活化的C因子内毒素活化的B因子B因子凝固酶凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原β葡聚糖或LAL-RM活化的G因子G因子

7、二价阳离子AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）AC-lle-Glu-Ala-Arg-OHpNA405nm测吸光度值（对硝基苯胺黄色）2007-9-1011Bitab3、BET用水2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素含量应少于0.005EU/ml。美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。200