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1、中国果树ChinaFruits1998(2):47—491998年5月*活体梨叶片透明方法实验技术与李保华赵美琦孙月海方法(中国农业大学植物病理系,北京100094)活体叶片透明技术是研究病原菌侵染、扩展、发清后,按乳酚油200mL无水乙醇132mL三氯甲烷病过程及寄主组织病变的重要方法。流行病害的定66mL的比例配成乳酚油透明液〔1〕。量研究,尤其对于果树叶部流行病害的定量研究,若透明将新鲜叶片直接浸入乳酚油透明液中,以叶片为试材,经透明处理后,不仅可检测病原菌孢室温下处理48小时。透明叶片量不能超过透明液量子侵入率、菌丝扩展长度,达到定量研究的目的,
2、而的1/2。且克服了以苗木为试材的诸多弊端。以病原菌侵染、扩展为观察目的的梨树活体叶片透明和染色方法,1.2染色与脱色以往未见报道。我们在梨黑星病的侵染、发病研究染色液的配制称取溴酚蓝1g,溶入100mL水中,将用于小麦条锈病组织学观察的水合三氯乙醛合三氯乙醛溶液中,配成1%溴酚蓝染色液。溴酚蓝煮沸透明〔2〕和乳酚油透明液透明技术〔1〕〔3〕引入到梨染色液可将梨黑星病菌的菌丝细胞壁染成蓝色,而黑星病的流行学定量研究中,并对这种透明方法的叶组织细胞不被染色。脱色液为饱和水合三氯乙醛。透明机理和各自应用范围作了进一步的研究。在组染色和脱色经上述两种方法透明的叶片
3、,浸织透明的基础上,进一步探讨了表皮剥离方法,以获入染色液中染色48小时。染色完毕,取出染色叶片,得对表皮表面结构和孢子侵染位点的清晰观察结用自来水漂去叶片表面的染色液,转入饱和水合三果。氯乙醛溶液中脱色24小时。脱色后的叶片以甘油作1材料和方法浮载剂制成半永久玻片;脱色后的叶组织也可在饱和水合三氯乙醛溶液中保存。材料为鸭梨不同叶龄(10—180日龄)完整叶片和叶片的活体徒手切片,厚度为20—100m。1.3表皮剥离表皮剥离液的配制将草酸和草酸铵分别配成1.1透明方法0.8%和3.2%的水溶液,使用时再按11的比例混合1.1.1饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透
4、明法即成〔4〕。透明液配制将水合三氯乙醛〔CCl3CH(OH)2〕表皮剥离方法将透明或染色脱色的叶片直接和蒸馏水按52(W/V)的比例混合,待水合三氯乙醛浸入表皮剥离液中处理24小时。处理完毕,取出叶片完全溶解后,即配成饱和水合三氯乙醛透明液〔2〕。并用清水冲掉表皮剥离液,用摄子撕取表皮,用毛笔刷去附着的叶肉细胞,即可以甘油作浮载剂制片观透明将饱和水合三氯乙醛加热至沸腾,立即察。放入待透明材料,煮沸1—5分钟。1.1.2乳酚油透明液透明法2结果透明液配制该透明液配制分两步,首先按苯酚20g甘油40mL乳酸20mL蒸馏水20mL的比本文于1998-01
5、-18收到。*本研究为国家自然科学基金资助项目,资助号:例,将其配成乳酚油,待苯酚完全溶解,溶液混匀澄39470475。本文承蒙曾士迈先生审阅,特致谢忱。4724小时的显微照片,照片中梨黑星病菌分生孢子接2.1饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明法种4天后在角质层下形成的菌丝(10×40倍)清晰可经饱和水合三氯乙醛透明的叶片,纵切片在显见。微镜下观察,仅能检查到叶组织细胞壁、细胞核和维2.2乳酚油透明液透明法管束的纤维素类物质,细胞膜和叶绿体、线粒体等细胞器均受到破坏,细胞内容物消失,这说明水合三氯经乳酚油透明液透明的叶片,其纵切片在显微乙醛主要通过破坏细胞膜、消解
6、细胞质,来达到透明镜下观察细胞结构完整,与透明前相比,细胞质稠效果。如果煮沸时间过长,细胞壁也将被逐渐消解。密,细胞质与细胞壁略有分离,叶绿体消解为多个微图A为饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透明后鸭梨叶片小的棕色颗粒,叶绿素消失。由此说明,该透明液主纵切片(10×4倍),图B为饱和水合三氯乙醛溶液煮要通过分解叶绿素,破坏叶绿体达到透明的效果,对沸透明后的叶肉细胞(10×40倍)。饱和水合三氯乙细胞膜和细胞质损伤不大。图C为该透明液透明的醛溶液煮沸透明对梨各龄期叶片都能获得较好的透鸭梨叶片纵切片(10×40倍),图D为叶肉细胞(10×明效果,不同龄期叶片透明需要煮沸
7、的时间有所差40倍)。乳酚油透明液透明鸭梨30日龄以内的幼叶和异,幼嫩叶片煮沸时间短,一般不超过3分钟;叶龄30叶绿素已开始分解的衰老叶片(10月中旬以后),均日以上的叶片,煮沸时间可适当延长,透明过程中可能获得较好的透明效果。透明后的叶片呈淡黄色、透随时检查透明效果,以叶片刚好完全透明为止。图F亮。图G是鸭梨25日龄叶片经乳酚油透明液透明48为鸭梨35日龄叶片经饱和水合三氯乙醛溶液煮沸透小时、溴酚蓝染色48小时、饱和水合三氯乙醛脱色24明3分钟、溴酚蓝染色48小时和饱和水三氯乙醛脱色小时后的显微照片,从该照片可清楚看到叶片正面图活体梨叶片两种透明方法的透明
8、机制及效果比较注:Co、Mc和St分别为梨黑星病菌的
