野生白及SRAP_PCR反应体系的优化_蒋瑞彬

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1、第31卷第2期中华中医药学刊Vol．31No．22013年2月CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEFeb．2013野生白及SRAP－PCR反应体系的优化蒋瑞彬，徐旭栋，蓝小明，王鸯妮，丁志山，金波(浙江中医药大学，浙江杭州310053)摘要:采用浓度梯度设计法研究适合白及的SRAP－PCR反应体系。对影响SRAP－PCR的DNA模板、引2+物、dNTP、Mg、Taq酶、退火温度等6个因素进行优化。最终确定白及的SRAP－PCR优化体系:在20μL体

2、系2+中，DNA模板30ng、Mg2．5mmol/L、dNTPs0．25μmol/L、引物20μmol/L、Taq酶2．0U，扩增体系为:94℃预变性5min;5个循环的94℃变性1min，36℃退火1min，72℃延伸1min;之后35个循环:94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸1min;72℃最后延伸5min。该体系的建立为野生白及种质资源遗传多样性的进一步相关遗传分析奠定了基础。关键词:白及;SRAP－PCR;体系优化中图分类号:R284．3文献标志码:A文章编号:1673－7

3、717(2013)02－0353－03OptimizationofSRAP－PCRReactionSystemofBletillastriataJIANGRuibin，XUXudong，LANXiaoming，WANGYangni，DINGZhishan，JINBo(ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053，Zhejiang，China)Abstract:Theconcentrationgradientwasusedtooptimizereac

4、tionsystemforsequence－relatedamplifiedpolymor-2+phism(SRAP)ofBletillastriata．ThesuitableconcentrationoftemplateDNA，primer，Mg，dNTPs，rTaqDNApoly-meraseandannealingtemperaturewereinvestigatedthroughsinglefactortest．TheSRAP－PCRamplifyingsystemwas2+optimiz

5、edwhichcameouttotal20μLreactionsystemcontaining:30ngDNAtemplate，2．5mmol/LMg，0．25μmol/LdNTPs，20μmol/Lprimers，2．0UTaqDNApolymerase，themostsuitablePCRamplificationprocedurewaspre－denatu-ringat94℃for5min;5cyclesofdenaturingat94℃for1min，annealingat36℃for1m

6、inandextendingat72℃for1min，then35cyclesofdenaturingat94℃for1min，annealingat48℃for1minandextendingat72℃for1min，extendingat72℃for10minfinally．TheoptimizedsystemlaidthegroundworkforSRAPmolecularanalysisandfurtherresearchonBletillastriata．Keywords:Bletill

7、astriata;SRAP－PCR;systemoptimization白及［Bletillastriata(Thunb．)Reichbf］兰科多年生源存在较大的种间遗传分化性，种内因来源不同的地理居小草本，以干燥块茎入药，是常用的药材之一，具有收敛止群、生态环境和自身遗传特性等也导致细微的变异，因此分［1］血、消肿生肌的功能。除临床药用外，白及还可用于食子标记技术在白及种质资源的鉴别和遗传多样性的研究具品及化工领域。因此白及用途广泛，综合利用潜力很有重要的作用。SRAP标记(Sequencere

8、latedAmplifiedPo-［2－4］lymophism)序列相关扩增多态性是2001年由Li和Qurios大。白及在人工栽培条件下繁殖速度很慢，繁殖系数［5］极低，而且因药材道地性观念的影响而造成的野生白及与开发的一种基于PCR的新型分子标记技术。SRAP技术栽培白及市场价格的悬殊，导致了人们对野生白及的过度具有操作简便、高效、共显性、重复性好、易测序、便于克隆采挖，加上兰科植物的种子萌发率极低，自然繁殖困难，所目标片段等特点，近年来在中草药遗传多样性分析、品种鉴以白及野生