植物外植体内生菌的分离与鉴定

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1、第27卷第5期唐山师范学院学报2005年9月Vol.27No.5JournalofTangshanTeachersCollegeSep.2005植物外植体内生菌的分离与鉴定李艳梅，李小六，陈超，王桂兰，武江英（唐山师范学院生物科学技术系，河北唐山063000）摘要：本试验以月季、白网纹草、一品红为材料，对其内生菌分离并进行一系列的生化特征鉴定试验及生长曲线测定试验、不同温度下菌株的生长情况试验等，经查阅《常见细菌鉴定手册》，可初步确定月季的内生菌属欧文氏菌属（Erwiniawinsloetal.,1920），白网纹草的内生菌属类芽孢

2、杆菌属(PaenibacillusAsh,Priest＆collin,1994)，[1]一品红的内生菌属短芽孢杆菌属(BrevibacillusShida,1996)。关键词：月季；白网纹草；一品红；内生菌；分离；鉴定中图分类号：Q93-3文献标识码：A文章编号：1009-9115（2005）05-0037-04[2]内生菌是指生活在植物体内，通常被宿主细胞膜包围或细胞质基质包围与宿主互惠共生的一类菌，包括真菌和细菌。尽管许多报道已证明在不同的植物体内都存在大量的内生菌，但对它们的分离与鉴定研究的较少。由于内生菌具有在植物体内独立自

3、主的分裂繁殖和传递的特性，使之有可能成为生物防治中有潜力的微生物农药和增产菌，因此分离并利用作物的内生菌控制作物的病虫害、开发有益内生菌以提高作物产量和品质的研究日益增多，也取得了可喜的成绩，显示了植物微生态学研究的意义和前景。本实验首次对月季、一品红、白网纹草的内生菌进行一系列研究，为内生菌的进一步研究打下了基础。1材料和方法1.1材料月季外植体，由唐山市园林处西郊苗圃提供；一品红外植体，白网纹草外植体，均由唐山师范学院组培室提供。1.2外植体的培养与内生菌的分离将采来月季的叶子剪掉，把带芽的茎切成若干小段，放入烧杯中，在烧杯口罩

4、一纱布，然后放在水龙头下冲洗约3个小时；用无菌镊子取出带芽的茎，无菌水冲洗3次，放入70％酒精中消毒30秒，继续用无菌水冲洗3次，放入1‰升汞中消[3]毒8分钟，再用无菌水冲洗3次；将小段茎的两端各切去一小段，倾斜将其插入培养基中。挑取月季的内生菌接到葡萄糖蛋白胨培养基上，于29℃恒温箱中培养，连续转接三次，然后划线分离；白网纹草和一品红的组培苗在组培室经过多次继代，依然在苗的茎部出现一圈菌落，即为内生菌，可直接分离得到。1.3月季、白网纹草、一品红内生菌的生长曲线的测定用记号笔在无菌大试管上标明培养时间,吸取2.5ml内生菌过夜培

5、养液转入盛有50mlLB液的三角瓶内，混合均匀后，分别取5ml混合液放入上述标记的无菌大试管中；将已接种的试管置30℃摇床上培养，摇床转速为180转／分钟，分别培养8h、16h、24h、32h、40h、48h、60h、72h，将试管取出后，用分光光度计测定其OD值。1.4不同温度下菌株生长情况测定试验接种同上，培养时间为2天，培养温度分别为25℃、30℃、35℃，然后用分光光度计测其OD值。1.5鉴定方法革兰氏染色法、芽孢染色、荚膜染色、甲基红试验、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、淀粉水解试验及生长曲线测定试[3][4]验和不同温度下

6、菌株的生长情况试验等。2结果与分析2.1月季、白网纹草、一品红外植体菌体及菌落形态三种外植体的三种菌体分别接种在葡萄糖蛋白胨培养基上，观察其菌落形态及油镜下菌体形态（见表1及附图1~6）。──────────收稿日期：2004-10-20作者简介：李艳梅（1972-），女，河南虞城人，唐山师范学院生物科学技术系讲师，理学硕士。-37-第27卷第5期唐山师范学院学报2005年第5期表1菌落及菌体形态菌体名称菌落形态菌体形态—月季内生菌淡黄色，较厚，光滑，湿润，边缘十分G，0.3~0.5×0.2~0.4μm短杆状，圆整，粘稠，不宜挑取。

7、单个较少，多呈链状，个体较小。—白网纹草内生菌乳白色，针尖状，较薄，光滑，边缘圆G，1.0~1.2×0.5~0.8μm,杆状，两整，干燥，易挑取端稍尖，单个或呈链状+一品红内生菌白色，菌落较小，菌落之间不相连，边G，0.7~1.0×0.4~0.6μm,短杆状，缘圆整，干燥，易挑取。两端钝圆，单个，偶见成对或成链。2.2月季、白网纹草、一品红内生菌的生长曲线0.40.350.30.25月季0.2白网纹草OD值0.15一品红0.10.050816243240486072816243240486072时间/h图1月季、白网纹草、一品红内生

8、菌的生长曲线以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，绘制三种细菌的生长曲线。由图1可见：三种内生菌的生长速度差异显著（F=6.4＞F0.05=3.47）月季内生菌的生长速度最快，一品红内生菌的生长速度次之，白网纹草内生菌的生长速