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1、中山大学学报(自然科学版)第39卷第1期ACTASCIENTIARUMNATURALIUMVol.39No.12000年1月UNIVERSITATISSUNYATSENIJan.2000文章编号:0529-6579(2000)01-0068-04海洋细菌的分子鉴定分类戴欣,陈月琴,周惠,周世宁,屈良鹄(中山大学生命科学学院,广州510275)摘要:从南海海底沉积物中分离到一批细菌,克隆了其中产抗菌活性物且培养形态多变的细菌ZS110的16SrDNA,通过测定和比较16SrDNA的部分序列,对ZS110进行了分子鉴定,结果表明它是一株适应了海洋环境的芽孢杆菌属(Baci
2、llus)的枯草芽孢杆菌种(Bacillussubtilis).关键词:海洋细菌;分子分类鉴定;16SrRNA中图分类号:Q939.1;Q751文献标识码:A目前从陆地微生物分离到的生物活性产物大部分是已知结构的化合物,而海洋微生物作为药物的新来源,正受到越来越多的关注.但对大量菌种的分类鉴定是一项繁琐、费时的工作,而且由于海洋独特的环境,包括高盐、高压、低营养、低温等,造就了海洋微生物有别于陆生微生物的许多特异性(如不易培养,形态多变且在保藏和移种过程中很容易[1]死亡等)而导致对它们种类区分的困难,不利于海洋微生物研究和开发的深入,因此迫切需要建立一些简单、方便、
3、易于操作的分类鉴定方法对海洋微生物进行分析,使人们在一定程度上更科学、更精确、更快速地找到海洋分离物的分类地位,为海洋微生物资源的[2]开发利用奠定基础.目前,大分子rRNA已成为一个分子指标,广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究,加上大量已知微生物的DNA都被测定并输入国际基因数据库,成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统,从而可以通过对未知微生物DNA序列的测定和比较分析,达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的.我们正在进行中国南海海洋微生物的资源调查工作,目前已从其海底沉积物中分离获得一批微生物,并从中筛选到具有抗菌活性的细菌ZS110,由于该菌在不同
4、培养条件下形态多变,甚至在同一培养条件下菌落形态也十分不稳定,因此本文应用16SrRNA作为分子指标直接对该菌进行分子分类鉴定,并对所得数据进行分析和讨论.1材料与方法1.1菌种来源从中国南海3个海区采集到9个样品,其中海底沉积物3个,底层水3个,表层水3基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870023);中国科学院大亚湾开放实验室基金资助项目(S9604);华南生物科学与技术研究基金资助项目收稿日期:1999-10-12作者简介:戴欣(1970～),女,讲师.第1期戴欣等:海洋细菌的分子鉴定分类69[3]个.从中分离获得120株细菌,抗菌实验表明其中ZS110菌
5、株能产生抗菌活性物.1.2细菌DNA制备将细菌接种在ZoBell2216E培养基平板上,37℃培养过夜.采用细菌单菌落直接PCR[4]扩增法制备细菌DNA,即取一单菌落溶于10μLρ=1%SDS溶液中,充分振荡摇匀,用300μLTE溶解获得DNA原液.将原液分别稀释10、100、1000倍作为PCR扩增模板.1.316SrRNA基因的PCR扩增和产物纯化应用标准的双链PCR反应扩增菌株的16SrDNA全基因片段.采用的引物为16(+):5牕GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3牕和16(-):5牕CGGCTACCTTGTTACGAC3牕,两引物间的距离约1500
6、碱基对.20μL反应液中含有:10×PCR缓冲液10%,MgCl21.5mmol/L,dNTP200μmol/L,引物各1.2μg,TagDNA聚合酶1单位.PCR扩增条件:94℃预变性4min后,接以94℃1min,50℃1min,72℃2min,循环30次,最后在72℃保温10min.扩增得到的产物经DNA纯化系统纯化.1.4PCR产物的克隆PCR产物经末端补平磷酸化并与载体pTJ19连接后转化到E.coliTG1菌株中,培养至对数生长期,用QIAprepSpinMiniprepKit(50)提取并纯化质粒DNA,该DNA直接用作测序的模板.1.5测序采用ABIP
7、RISMTM377DNASequencer进行序列测定,引物序列为16(+):5牕GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3牕和N3R:5牕T(GA)CGCATTTCACCGCTACAC3牕.1.6序列的数据处理将序列数据与Genbank中已存在的细菌16SrRNA基因序列应用BLAST程序进行相似性比较.2结果与讨论2.1单菌落直接PCR扩增法采用单菌落直接PCR扩增法,减少了海洋细菌DNA提取过程中可能带来的其他细菌尤其是陆生微生物的污染,且具有快速、简便、重复性好等优点.结果表明,单菌落裂解后所获得的DNA原液、稀释10倍、100倍、1000
