普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定

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1、第39卷第2期北京化工大学学报(自然科学版)Vol．39，No．22012年JournalofBeijingUniversityofChemicalTechnology(NaturalScience)2012普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定11*222332，4李晨晨吕杰杨瑞娟严亮季爱兵赵远艳李艳华盛军(1．北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029;2．普洱茶研究院，云南普洱665000;3．云南省普洱茶树良种场，云南普洱665000;4．云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室，云南昆明650201)摘要:对普洱茶发酵全过程的茶样进行了pH检测，发现在渥堆过程中pH

2、在前期有所下降达到4.5，中期基本趋于稳定，后期又有所回升。根据渥堆过程中高温和偏酸性的特征，采用传统培养与分子生物学方法相结合，对全过程的茶样在高温条件下进行细菌的分离、纯化及鉴定。结果发现有大量嗜热细菌的存在，包括凝结芽孢杆菌Bacil-luscoagulans，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis，热嗜淀粉芽孢杆菌Bacillusther-moamylovorans，Bacillusshackletonii，喜热噬油芽胞杆菌Geobacillusthermoleovorans，乳酸片球菌Pediococcusa

3、cidilacti-ci，植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，等。这些嗜热细菌和嗜热真菌一起在普洱茶的发酵中起到了关键作用。关键词:普洱茶;渥堆发酵;pH值;嗜热细菌中图分类号:Q93母，如黑曲霉，Blastobotrysadeninivorans，其通过做引言PCR-DGGE也证实了以上这两种真菌的存在。Chen［10］普洱茶是以云南大叶种制成的晒青毛茶作为原等对两种不同年代的普洱茶通过37℃培养，分料，经发水、渥堆、陈化及干燥工序精制而成的后发离得到了青霉属，根霉属，酵母属和细菌类等。前人酵茶。近几年来，随着对普洱茶的深入研究，越来越对普洱茶发酵过程的研究

4、均是在37℃及以下，用一多的研究证实了普洱茶的诸多功效，如抗氧化，抗突种或两种培养基进行微生物培养，而本研究针对普［1－4］变，杀菌，抗肿瘤，降血脂，降血压和降血糖等。洱茶高温发酵环境，采用高温(45℃和55℃)条件，普洱茶生产过程中微生物的发酵作用对其品质形成多种培养基进行了分离培养。起决定作用，离开微生物和湿热作用，晒青毛茶难以本课题组对普洱茶渥堆的堆温和茶样的含水量［5］形成普洱茶特有的陈香和红褐的汤色。进行了分析并采用高温培养分离得到了大量嗜热真近年来，国内外对普洱茶发酵过程中微生物的菌，如微小根毛霉Rhizomucorpusilus，牛根毛霉Rhi-［6］研究已有报道，

5、赵龙飞等对渥堆发酵生产的翻堆zomucortauricus等［11］。本文检测了普洱茶发酵过茶样进行微生物的分离培养，得到了黑曲霉，酵母程中pH的变化。在高温条件下根据相应的pH值菌，米曲霉，根霉，灰绿曲霉，但并没有发现细菌。方对茶样进行了细菌的分离与鉴定，并对分离得到的［7］祥等从不同贮藏期的普洱茶中分离得到了霉菌、细菌进行了16SrDNA序列测定分析，得到了多种酵母、细菌(芽孢杆菌、球菌、无芽孢短杆菌、乳酸高温生长的嗜热细菌。［8］茵)、放线菌。赵龙飞等从四次翻堆茶及出堆样中分离得到了黑曲霉属、青霉属、根霉属、灰绿曲霉1材料与方法［9］属、酵母属、细菌类。Abe等用孟加拉红培

6、养基，1.1原料PDA培养基在30℃培养，分离得到了真菌包括酵渥堆原料为云南大叶种晒青毛茶，共5t，原料含水量为8.8%(质量分数)，潮水量为36.5%(质收稿日期:2011－10－27量分数)。基金项目:云南省科技厅州、市党政“一把手”科技工程(2008QA028)1.2培养基第一作者:女，1986年生，硕士生LB培养基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，*通讯联系人氯化钠10，琼脂18。E-mail:lvjie@mail．buct．edu．cnYEPD培养基(g/L):酵母粉10，蛋白胨20，葡第2期李晨晨等:普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定·75·萄糖20，琼脂

7、18。(3)复性(退火)57℃30s;(4)延伸68℃2min，步查氏培养基(g/L):蔗糖30，硝酸钠2，磷酸氢骤(2)～(4)循环45次;(5)4℃保温;将PCR产物二钾1，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸铁0.01。送至北京博艾永华测序部，根据测序结果，在MRS培养基(g/L):蛋白胨10，牛浸膏10，酵母BLAST系统中查出相应微生物，完成菌种鉴定。提取物5，葡萄糖20，吐温801mL/L，柠檬酸氢二铵上游引物27F2，MnSO4·H2O0.25，MnSO4·7H2O2，