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1、动物医学进展,2009,30(3):63268ProgressinVeterinaryMedicine文综综述3基因差异表达分析技术在寄生虫学中的应用研究进展1,232123夏艳勋,李国清,苑纯秀,赵传璧,林矫矫(1.郑州牧业工程高等专科学校动物医药系,河南郑州450011;2.中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;3.华南农业大学兽医学院,广东广州510642)摘要:生物体表现出的各种生物学特性,主要是由于基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性差异表达引起的。这些基因的差异表达按特定的时间和空间顺序有序地进行着,决定了生命活动的多样性。而基因差异表达
2、研究的各种分析技术正是在此基础上发展起来并在兽医寄生虫学中得到广泛应用。以mR2NA差异显示、抑制消减杂交法和DNA微列阵分析等为代表的基因差异表达分析技术,在基因表达谱的分析及基因生物学功能研究,阐述寄生虫的发病机制,寄生虫疾病诊断,筛选合适的药物靶标和疫苗候选分子有效地防病治病方面发挥着重要作用。关键词:基因差异表达分析技术;寄生虫学;应用中图分类号:Q781文献标识码:A文章编号:100725038(2009)0320063206随着基因组计划的进展,从大肠埃希菌到人类(G、C、T或A),这2个碱基共有12种组合,由此设的多种生物的基因组序列逐渐被研究清楚
3、,分子生计一套锚定引物5′2T12MN(M,N表示4种碱基中物学已进入功能基因组学(后基因组)时代,这些序的1种,M不能为T),通过反转录技术将总mRNA列蕴涵的功能将成为主要的研究目标。高等生物约在cDNA水平上分成12个亚群[3]。之后用20种有10万个不同的基因,但仅有15%左右的基因表10mer的5′端随机引物对12个亚群的cDNA进行[1]达,并且不同组织细胞间的基因表达不同。基因PCR扩增,PCR体系中加入放射性标记的dNTP,表达的变化是细胞生命活动调控机制的核心,调控PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影后,生命过程的发育和分化、对刺激的反应
4、、细胞循环的判读差异条带。对于相同的cDNA,PCR产物的种调节、衰老以及细胞程序性死亡。基因的差异表达类和分布应该是完全相同的。将凝胶上有差异的条有两种方式,即表达基因的种类改变(新出现或消带切下来再进行PCR扩增,产物作为探针对样品进失)和同一类基因表达量的改变(上调或下调)。由行Northern印迹分析,以进一步验证该cDNA是否于生命系统是一个高度有组织的多基因的网络效真正差异表达。统计分析表明,12种锚定引物与20应,因此以全面系统的观点从基因组水平上研究基种随机引物组合进行PCR能产生出20000条左右因调控网络及其机理,揭示不同层次多基因协同作的D
5、NA条带,涵盖了在一定发育阶段某种细胞类用,寻找和发现新的基因及其功能十分必要。一些功能强大的基因差异表达研究新技术新方法随之应型中所表达的全部mRNA。运而生,并迅速应用于生命科学的许多领域[2]。1.2cDNA代表性差异分析技术1基因差异表达分析技术的基本原理和方法cDNA代表性差异分析技术(representationaldifferenceanalysisofcDNA,cDNA2RDA)是在基因1.1mRNA差异显示技术组RDA基础上发展起来的分析mRNA差异表达的mRNA差异显示技术(differentialdisplayof[4]技术。其基本过程是将
6、含有目标序列的实验组及mRNAbymeansofthepolymerasechainreaction,DD2PCR)是根据大多数真核生物mRNA3′末端都与之比较的驱动组mRNA反转录成cDNA,然后将有poly(A)尾,在poly(A)前面的第一位碱基(A除两组cDNA用识别4个碱基的限制性内切酶消化外)有3种可能(G、C或T),第二位碱基有4种可能(如DpnⅡ)。对于识别4个碱基的内切酶来说,平3收稿日期:2008212201基金项目:国家高技术研究发展计划项目(2006AA10A207);国家自然科学基金项目(30371082)作者简介:夏艳勋(1971-
7、),女,河南焦作人,讲师,博士,主要从事寄生虫分子生物学研究。3通讯作者64动物医学进展2009年第30卷第3期(总第188期)均每256个碱基就有一个识别位点,可以确保绝大列与第2次PCR引物序列相同,有利于后续PCR部分种类的cDNA至少产生一个可以扩增的片段,的筛选扩增,此外接头上含有T7启动子序列及内代表性由此产生。试验组和驱动组的酶切产物分别切酶识别位点,为以后连接克隆载体和测序提供方与第一组寡核苷酸接头R12/24连接,其中R接头便。第3步两轮消减杂交。第1轮消减杂交中用过中12mer片段为去磷酸化的短核苷酸链,以非共价量的driver分别与test
8、er2adaptor1和
