采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察

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1、广西医科大学学报2003Dec;20(6)894JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察123111张海添陆云飞李卫李辰生唐卫中林伟雄陈剑锋金琪(广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科南宁530021)摘要目的:观察采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目的PCR产物的效果。方法:使用不同的31对引物,45例标本行PCR扩增出不同的目的DNA片段,将每一份PCR产物分为2份,其中1份直接测序,为对照组;另1份则做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,以分离出的目的DNA片段单链为模板行2次PCR,对2次PCR产物测序,

2、此为实验组。结果:实验组只有4例不能被测序仪判读(4/45),而对照组有24例不能被测序仪判读(24/45),两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)结论:根据单链DNA片段形成构象的不同来纯化PCR产物可达到更好的纯化效果。关键词PCR产物纯化;电泳;DNA测序中国图书资料分类法分类号Q51随着分子生物学技术的发展,纯化DNA片段的方法也1.2.2引物设计:根据文献[1]合成引物。在不断的改进。提取DNA的过程可以说就是纯化DNA的1.2.3PCR扩增:PCR反应体积10Ll,95℃2min,94℃30方法之一。对于特定的DNA片段,过去采用的方法是根据s,54～58

3、℃30s,71℃30s,共30～35个循环,PCR产物在DNA片段的长短对目的DNA片段进行纯化。但这种纯化的4℃保存。31对引物中,有17对引物扩增产物以巢式PCR扩方法当遇到目的与非目的DNA片段系列在碱基长度上相同增得到目的PCR片段。或相近时,很难把两者分离出来,因而具有局限性。我们采用1.2.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:取以上PCR产物各2非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR产物的目的DNA片段Ll行SSCP。方法如下:¹配电解缓冲液(400ml):0.025纯化后作为2次PCR的模板,再对2次PCR产物进行测序,mmolTris1.2114g,0.088mmol甘

4、氨酸2.642g。º配12%取得较好的效果,现报道如下。聚丙烯酰胺凝胶3ml。»灌胶:将两支封条放在两块玻板之间的左右两边,再用夹子夹住玻板,将配好的胶沿玻板缓缓1材料与方法加入两块玻板之间,然后插上梳子,静置1h。¼装好电泳槽,1.1材料:标本为1995年1月1日至2002年10月30日在用琼脂糖封4边,拔梳子,倒入电解缓冲液,用注射器冲洗上我院住院手术的乳腺癌和大肠癌患者的癌组织标本45例。样孔。4Ll溴酚蓝加1Ll的扩增产物,在93～98℃之间变性这些标本经提取DNA行PCR后,进行单链构象多态性分析3min,立即拿出放入冰浴。½加样,倒入电泳液,放入恒温箱(SSC

5、P)筛查和测序确定有目的DNA突变。所提取的DNA9～24℃,300V,500ml,3～6h。¾电泳后拆板,用10%乙酸为模板的PCR产物直接进行测序为对照组;第1次PCR产固定10min,再用水冲洗2次,加蒸馏水浸泡3min,重复一物行SSCP后,取SSCP胶中怀疑的突变区带(内含目的次,倒干水。¿20ml银染液中加37%福尔马林30Ll,染色。DNA片段单链)为模板,进行第2次PCR的产物测序为实轻摇15min。À加20mlNa2CO3(30g/L)+Na2S2O3(2g/验组。所有目的DNA片段碱基系列由上海生工公司测定。L)20Ll+37%福尔马林液30Ll,不断

6、摇动,倒出染液。Á1.2方法10%乙酸固定3～5min即可。1.2.1提取DNA的方法:¹取标本1～5g捣碎,加入少许1.2.5用Tip头从聚丙烯酰胺凝胶中挑出一小点含突变区Tris液置入匀浆器中研磨碎后移入试管。º加入等体积饱和带的凝胶,用10～300Ll去离子水浸过,打碎凝胶使目的苯酚摇匀,离心。»移上清入另一试管,再加入等体积饱和苯DNA片段溶于水中。离心。取1～3Ll上清作为模板,以相应酚后摇匀,再离心。¼移上清入另一试管,加入等体积氯仿后引物行2次PCR。PCR产物由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。摇匀,离心。½重复步骤¼。¾移上清入另一试管,加入2.5以2次PCR

7、产物作为实验组的目的DNA片段测序。体积无水酒精沉淀DNA,将DNA移至小离心管内,75%酒1.2.6测序结果机器判读的标准:在DNA测序报告图中,精漂洗2～3次,干燥后用去离子水或TE溶解待用。从标记的第70位碱基算起,至与测序引物对应的上游或下游引物所在位置止,凡2个碱基位点以上出现近似高度的双峰(双峰被机器判读为“N”)者,视为“不能机器判读”(图1);1儿科实验室2在读研究生相反,凡无或只有1个碱基位点出现近似高度的双峰者,视3大肠肛门外科为“能机器判读”(图2)。收稿日期:2003-07-101.2.7统计分析:采用