RNAi基础知识I

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1、RNAi—双链RNA引起的基因敲除（一.RNAi的机理）--一.RNAi的机理目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。㈠.参与RNAi反应的酶RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。Dicer酶广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物

2、及哺乳动物体内。它的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（shortinterferenceRNA）[2]，它启动了细胞内的RNAi反应。由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directedRNApolymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞

3、内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。㈡RNAi的反应过程双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白[3]。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链[4，5]。结果mRNA也变成了双链RN

4、A，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。二.哺乳动物细胞中的RNAi在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi，将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的RNAi机制，并抑制了报告基因的表达[6]。但大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非

5、特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活。细胞内干扰素产生增加，蛋白激酶PKR激活，使转录因子E2F被抑制，非特异的阻断基因的转录，并诱导细胞凋亡。另一方面，RNA酶L(RNaseL)被激活，产生非特异的mRNA降解。而未分化的胚胎细胞中，上述防御病毒的机制存在缺陷，因而双链RNA能特异的阻断基因的表达。由于大于30个核苷酸的双链RNA非特异的阻断哺乳动物成体细胞中的基因表达，RNAi在哺乳动物成体细胞中的应用受到限制。但Tuschl等人的研究工作克服了这一障碍。他们发现，21个核

6、苷酸的双链RNA能够诱发哺乳动物细胞内的RNAi机制，同时不会激活细胞内的干扰素[7]。他们合成了以荧光素酶的mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA，将它和荧光素酶的表达质粒用脂质体共转染到NIH3T3,COS-7,HelaS3,293细胞中，报告基因的表达被抑制了90%。由于报告基因得到的结果不能完全说明细胞内的情况，他们又合成了细胞内源性基因laminA/C为靶目标的双链RNA，这个双链RNA也特异的抑制了laminA/C的表达，抑制率达到90%以上。根据一条mRNA的不同靶位点可以合成出许多条双链RNA，研究发现这些双链RNA

7、的作用差别很大[8]。其中转录起始位点，编码区的3’末端为靶点的双链RNA的效果很差。而GC含量低的区域似乎双链RNA的效果好。线虫内的siRNA可以作为引物，以靶mRNA为模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量扩增siRNA。将siRNA的3’末端标记上FITC使它丧失引物的作用，在将其转入哺乳动物细胞内，它抑制靶基因的作用并没有受到影响。因而研究者推测，哺乳动物细胞内不存在象线虫那样的依赖于RDRP的RNAi放大机制。在哺乳动物细胞中瞬时转染dsRNA后，dsRNA的作用只维持了三天。而将表达dsRNA的载体转入哺乳动物细胞后筛

8、选出的稳定表达株中，在转染八周后dsRNA仍能有效的抑制靶基因的表达[9]。利用载体表达出的dsRNA为发夹结构，其环状部位的核苷酸的序列和数目对dsRNA的作用都有影响，研究者发现9个核苷酸比5个或7个核