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1、第32卷第2期南华大学学报·医学版2004年4月Vol.32No.2JournalofNanhuaUniversity(MedicalEdition)Apr.2004石蜡切片厚度对流式细胞仪检测细胞周期分析的影响唐国华,龙治峰,贺修胜,唐朝克,何淑雅,唐新民(南华大学科研试验中心,湖南衡阳421001)摘 要:目的 探讨石蜡包埋组织制备单细胞悬液过程中,切片厚度对流式细胞仪检测结果的影响。方法 以小型猪的肠系膜淋巴结为实验对象,将淋巴结分别制成新鲜组织单细胞悬液和石蜡组织块;石蜡组织块切割成不同厚度的薄片,再制成单细胞悬液;流式细胞仪分别检测其DNA含量;采用M
2、ultiCycleforWindows分析软件分析它们之间的差异。结果 新鲜组织的G0/G1期、S期、G2/M期细胞所占比例、G0/G1峰的CV值及Debris值与石蜡组织之间存在差异;而不同厚度石蜡切片组织间制备的样本所测结果亦不相同。结论 不同厚度石蜡切片组织制备的细胞悬液,对流式细胞仪检测细胞周期分析的结果有影响;以采用60μm厚的切片组织制备细胞悬液为最佳。关键词:流式细胞仪;DNA; 石蜡切片中图分类号:R730.43 文献标识码:A 文章编号:1672-7444(2004)02-0226-04 在肿瘤研究中,应用流式细胞仪技术分析肿1 材料
3、与方法瘤细胞的DNA含量及周期细胞群体数目,已成为肿瘤临床诊断、疗效评价及预后推测的重要参考1.1 材料与仪器1,2依据。DNA双螺旋结构碱基对与某些核酸荧肠系膜淋巴结取材于10只小型猪,将同一淋光染料有良好的亲和力,在激发光的激发下,产生巴结切割成大、小2块。大块组织经梯度酒精脱特定的荧光,运用流式细胞仪检测并分析这些荧水、二甲苯透明、石蜡包埋;小块组织立即制备细光强度,从而了解细胞群体中各周期的分布状况,胞悬液。碘化丙啶(PI)、RNAse、磷酸盐缓冲液、胃即G0/G1期、S期、G2/M细胞所占的百分比例。蛋白酶、TritonX-100、酒精、盐酸(1mol
4、/L)、切片检测细胞周期状态的标本,可以是培养细胞、机(德国产)、恒温水箱、电冰箱、振荡器、离心机、实体组织细胞及体液中收集的细胞;亦可以是新酸度计、分析天平、过滤网、流式细胞仪(美国产鲜组织,冰冻组织及石蜡包埋组织。尤其是石蜡AltraHypersortSystem)。包埋组织,已成为利用流式细胞仪进行回顾性与1.2 单细胞悬液的制备追踪性研究的材料。然而在利用石蜡包埋组织进1.2.1 石蜡包埋组织的单细胞悬液制备 石蜡行细胞周期分析时,其结果与新鲜组织比较,主要包埋组织,用切片机进行连续切片,其切片厚度分3,4受到细胞碎片(Debris)的影响。Rabino
5、vich认别为80μm、60μm、40μm、20μm,将组织切片成制为这可能是石蜡包埋组织在制备单细胞悬液时,备1×106个单细胞悬液。其步骤如下:将切片分切片切面的部分细胞被切割,经消化酶消化后,被别置入4只试管,加入8mL二甲苯室温脱蜡,24切割的细胞将变成细胞碎片。为探讨石蜡包埋组h、5h,弃二甲苯;依次加入100%、95%、70%、织制备单细胞悬液过程对流式细胞仪检测结果的50%的梯度酒精5mL洗去二甲苯至水,每步间隔影响,本研究采用不同厚度切片组织与新鲜组织10min,弃酒精;加入蒸馏水5mL,洗涤10min;弃进行对比研究。蒸馏水,加入2mL0.5%
6、的胃蛋白酶(pH1.5～2.基金项目:湖南省自然基金资助项目(批号03Jjy3029).通讯作者:贺修胜,博士后,南华大学病理解剖学副教授,联系电话:0734-8281510.Email:tgh1@163.com.2260)消化液,置37℃恒温水箱中轻轻震荡,水浴消器的线性度。化5～10min;消化完毕,加入生理盐水终止消化,(3)直方图标记荧光道数的值为512。G0/G1以300目尼龙网过滤、1500rpm离心,5min;生理峰荧光道数为100以上,通过调节PMT(光电倍增盐水漂洗,500rpm,10min离心2次。对未消化完管)的电压值,获得正常二倍体细胞的
7、G1峰的理全的组织块进行二次消化。想位置。1.2.2 新鲜淋巴组织单细胞悬液的制备 2～4(4)阈值设置。3mm组织,加入2mL0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～1.5 分析软件 2.0)消化液。其余步骤同上。采用MultiCycleforWindows分析软件分析,分1.3 染色析模型见图1。使用SPSS11.0统计软件进行统计1.3.1 染液配制 PI0.2mg、枸橼酸钠100mg、分析。NaCl156mg,TritonX-1001.0%,RNAse1μg/mL,蒸馏水100mL,配制成20μg/mLPI的去污染液。2 结 果1.3.2 细胞染色 用PBS将
8、细胞悬浮浓度调至61×1
