EP_7.0_2.6.12_非无菌产品的微生物限度检查

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1、欧洲药典7.02.6.12非无菌产品的微生物限度检查：微生物计数试验1.简介：该法所描述的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制剂是否符合微生物质量的既定标准。如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来进行结果解释。该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。如果与药典的等效性作了相关说明，可以使用自动收集法作为替代法。2.一般步骤设计方法时所用条件要避免外在微生物对待测产品的污染。必须釆取措施，使其不影响任何待测微

2、生物。如果待测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。3.计数方法按规定用微孔滤膜法或平板计数法。MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但如果某些产品所含微生物的量极少，则该法是最合适的。方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物限量。所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断其是否符合标准。所选方法的适用性必须建立。4.促生长实验、计数法的适用性和阴性对照4

3、-1总则该试验检测产品中微生物的检测能力必须被验证。如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适适用性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。4-2试验菌株的准备使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。使用批菌种培养技术（seed-lotsystems）使得用于接种的微生物从最初的主批种子传代不多于5次。细菌和真菌试验株的生长分别见表2.6.12-2。使用氯化钠蛋白胨（pH7.0）缓冲液或pH7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。对于黑9欧洲药典7.0曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。在两小时

4、内使用该菌悬液或2-8℃下可保存24小时。作为一种可替代的制备方法，稀释含有黑曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有营养细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。该孢子悬浮液可以在2-8℃保存至已经验证的期限。4-3阴性对照为了验证试验条件，必须使用特定的稀释液作为阴性对照来替代测试液。在该阴性对照品中必须没有微生物生长。按“5”项的方法检测样品时，同样需要对照组。如果阴性对照试验失败的话需要分析原因。4-4促生长培养基测试每一批准备好的培养基，

5、每一批培养基，要么为脱水培养基要么含有所述成分。用表2.6.12-1中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到含有大豆蛋白胨消化肉汤的液体/平板和大豆蛋白胨消化琼脂上，对每一种使用各自的含有培养基的液体/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到沙氏－葡萄糖琼脂平板，对每一种微生物使用含各自培养基的平板。接种条件见表2.6.12-1。对固体培养基而言，以标准接种物来说，所得的生长值不超过计算值的两倍。与用先前的测试方法和验证的批培养基所得的测试结果相比，新制备的接种物将会出

6、现微生物的生长值。与用先前的测试方法和验证的批培养基所得的测试结果相比，如果微生物生长清淅可见，则液体培养基是合适的。9欧洲药典7.0表2.6.12.-1-微生物制备和使用9欧洲药典7.09欧洲药典7.0微生物受试菌株制备促生长在产品存在的情况下的计数方法的适应性需氧菌总数总酵母菌和霉菌数需氧菌总数总酵母菌和霉菌数金黄色葡萄球菌如：ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤30-35℃18-24小时酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤≤100CFU

7、30-35℃≤3天酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤≤100CFU30-35℃≤3天铜绿假单胞菌9欧洲药典7.0如：ATCC9027NCIMB8626CIP82.118NBRC13275酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤30-35℃18-24小时酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤≤100CFU30-35℃≤3天酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤≤100CFU30-35℃≤3天枯草杆菌如：ATCC6633NCIMB8054CIP52.62NBRC3134酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消

8、化肉汤30-35℃18-24小时酪蛋白大豆消化琼脂或酪蛋白大豆消化肉汤≤100CFU30-35℃≤3天酪蛋白大豆消化琼脂/MPN酪蛋白大豆消化肉汤≤100CFU30-35℃≤3天白色念珠菌如：ATCC10231NCPF3179IP48.72NBRC1594沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤20-25℃2-3天酪蛋白大豆消化琼脂≤100CFU30-35℃≤5天沙氏葡萄糖琼脂≤100CFU20