非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法.docx

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1、非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法浙江省食品药品检验研究院郑小玲主要内容1计数方法的概况2计数培养基适用性检查3供试品计数方法适用性检查4供试品检查5结果判断计数方法的概况有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数平皿法不适用活菌制剂的检查薄膜过滤法MPN法受控环境洁净环境下的局部洁净度不低于B级确认方法的适用性可采用替代方法计数方法的概况细菌数：营养琼脂培养基，需氧菌总数（TAMC)：修订后胰酪大豆胨琼脂（TSA），30～35℃，3天胰酪大胨肉汤（TSB）霉菌和酵母菌数：玫瑰红30～35℃，3～5天钠琼脂培养基，20～28℃，霉菌和酵母菌总数（TYMC)：5天。酵母菌计数：酵母浸出

2、沙氏葡萄糖琼脂培养基，粉胨葡萄糖琼脂20～25℃，5～7天计数培养基适用性检查•菌种及菌液制备菌种：标准菌株(CMCC)，传代次数不超过5代金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲菌液制备：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制菌悬液。菌液制备后室温放置，2小时内使用；2～8℃，24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。•阴性对照以稀释剂进行阴性对照组，应无菌生长计数培养基适用性检查TSA、TSB、SDA：1、实验用菌株：TSA:金葡、铜绿、枯草、白念、黑曲TSB：金葡、铜绿、枯草SDA:白念、黑曲2、接种：TSA、SDA:涂布法、倾注法。

3、TSB：直接接入接种量不大于100cfu，细菌30～35℃培养不超过3天，真菌20～25℃培养不超过5天。每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。对照培养基替代被检培养基同法操作。3、TSA、SDA与对照培养基比较，回收率为50%～200%，菌落形态与对照培养基一致。TSB与对照培养基比较，试验菌应生长良好。玫瑰红钠培养基、SDA+抗生素、选择性培养基计数方法适用性检查供试液制备1.液体供试品2.固体、半固体或黏稠性供试品修订后3.需用特殊方法制备供试液的供试品（1）非水溶性供试品（2）膜剂（3）肠溶及结肠溶制剂（4）气雾剂、喷雾剂（5）贴剂（6）具抑菌活性的供试品1.水溶性供试品2

4、.水不溶性非油脂类供试品3.油脂类供试品4.需用特殊方法制备供试液的供试品（1）膜剂（2）肠溶及结肠溶制剂（3）气雾剂、喷雾剂（4）贴膏剂如药典上所列方法经确认不适用，可采用其他适宜方法。计数方法适用性检查稀释液1.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨1.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液修订后2.pH7.2磷酸盐缓冲液缓冲液3.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）（用于肠溶制剂）4.pH7.6无菌磷酸盐缓冲液3.pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）（用于结肠溶制剂）5.TSB6.不局限上述稀释液计数方法适用性检查接种和稀释1、总需氧菌计数用5种

5、菌。2、菌液加入供试液中，接菌量不大于100cfu，所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。3、选择最低稀释级的供试液进行试验。3、培养时间、可接受标准同培养基适用性检查。试验组供试品对照组稀释剂对照组？菌液对照组计数方法适用性检查抗菌活性的去除或灭活1、增加稀释液或培养基体积.2、加入适宜的中和剂或灭活剂。3、采用薄膜过滤法。4、上述几种方法的联合使用。若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有抗菌活性，同时也表明供试品不可能被该类微生物污染。但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合

6、的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查。计数方法适用性检查供试品中微生物的回收1、平皿法：每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿。倾注法、涂布法2、薄膜过滤法：孔径不大于0.45μm,直径为50mm,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过1000ml。3、MPN法：不适用于霉菌计数。若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择回收最接近要求的方法

7、和试验条件进行供试品的检查。供试品检查1、检验量：另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4片。2、供试品的检查：需氧菌总数（TSA)、霉菌和酵母菌总数(SDA）3、阴性对照试验：以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，应无菌生长。如果有菌生长，应进行偏差调查。4、实验方法：平皿法：每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。薄膜