ELISA 知识简介

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1、3.2.3　结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白

2、质上的氨基形成chiff氏碱而结合。此法简便有效按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节

3、省。在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，3.2.4　结合物的保存酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓

4、冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。3.2.5　结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可

5、应用这种稀释液。3.3　酶的底物3.3.1　HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+H2O2——D+H2O上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]。OPD氧化后

6、的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ur

7、eaperoxide)。3.3.2　AP的底物AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。5　　AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。3.4　洗涤液　　在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。3.5　酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L

8、。3.6　阳性对照品和阴性对照品阳性对照品(positivecon