elisa知识简介

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1、ELISA知识简介暨南大学生命科学技术学院免疫学教研室向军俭jnuxz1.免疫检测的基础知识ELISA是一种免疫测定。免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。1.1抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。1.2抗体1.2.1抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与

2、免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。IgG的结构(见图1)。重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图2），是抗体专一性结合抗原的结构基础。图1IgG的结构①木瓜酶裂解部位②胃蛋白酶裂解部位图2VH和VL两者构成

3、抗体的抗原结合部位与相应的抗原决定簇匹配及结合的图示1.2.2抗体的产生机体受抗原刺激后，B淋巴细胞产生相应的抗体。先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。（图3）为为甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM抗体出现的时间和水平。图3甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM抗体出现的时间和水平。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定

4、簇的抗原注入机体，将由多系的B细胞产生相应的多种抗体，这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体monoclonalantibody，McAb或Mab）。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。1.3抗原抗体反应1.3.1可逆性

5、抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。1.3.2最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物.抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zoneofquivalence）。在等价带前后分别为

6、抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zonenomenon）。抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。1.3.3特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），随来源于同一病毒，但

7、仅与其相应的抗体结合，而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物（例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交叉反应。1.3.4敏感性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg，其敏感度可达0.1

8、ng/ml。1.4免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备