金黄色葡萄球菌基因敲除质粒的构建及应用

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1、中国组织工程研究第19卷第5期2015–01–30出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJanuary30,2015Vol.19,No.5www.CRTER.org金黄色葡萄球菌基因敲除质粒的构建及应用卫玮，李晓玲，袁文常(解放军兰州军区乌鲁木齐总医院临床检验诊断中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830000)文章亮点：1耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为全球院内感染的首要致病菌，建立快速简单的基因敲除方法是研究耐卫玮，女，1984年生，四甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力、耐药性的重要技术。

2、川省剑阁县人，汉族，20062用于金黄色葡萄球菌基因敲除的质粒主要使用温敏性质粒，如pBT2、pYT3等。由于pYT3质粒主要通过年新疆大学毕业，主管技师，主要从事细菌耐药方酶切的方式构建，所以该质粒中可以利用的多克隆位点只有BamHⅠ、SalⅠ、HindⅢ3个酶切位点，这就面的研究。使得在构建不同的敲除载体过程中会受到一定的限制。因此在实验中，作者通过分子生物学方法构建了较为实用的大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒，并对金葡菌基因进行敲除，建立了简单的金葡菌基因敲除技术。通讯作者：袁文常，博士，3作者已应用大肠杆菌-金黄色葡萄球

3、菌穿梭质粒pYZ1/pYZ8质粒对金葡菌多个基因进行敲除，其成功构建主管技师，解放军兰州军及应用为进一步研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性的毒力提供了有力保障。区乌鲁木齐总医院临床检验诊断中心，新疆维吾尔关键词：自治区乌鲁木齐市实验动物；组织工程；金黄色葡萄球菌；甲氧西林；毒力；耐药性；质粒；基因敲除；同源重组；国家自然830000科学基金主题词：doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.025抗甲氧西林金黄色葡萄球菌；毒力；基因敲除技术；质粒[http://www.crter.org]基金资助：

4、国家自然科学基金青年项目(81401703)中图分类号:R318文献标识码:B摘要文章编号:2095-4344(2015)05-00799-06背景：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经成为全球院内感染的首要致病菌，建立快速简单的基因敲除方法是研稿件接受：2014-11-03究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌毒力、耐药性的重要技术。目的：构建适用于金黄色葡萄球菌基因敲除的质粒，用于金葡菌耐药性及毒力的研究。方法：以pUC19为构建的基本骨架，通过overlapPCR的技术手段，把pCL52.1中pLE194Ts温敏复制子及质粒pHY300PLK

5、中四环素抗性基因片段，通过高保证扩增后，连接入pUC19的EcoRⅠ位点，保留pUC19中所有的多克隆位点，构建大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒，并对金黄色葡萄球菌N315dapB基因进行敲除，通过多重PCR对基因敲除菌株进行鉴定。结果与结论：成功构建了大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒pYZ1和pYZ8，并用于金葡菌基因的敲除，通过酶切及overlap技术构建了同源重组质粒pYZ-ΔdapB，电转入RN4220进行修饰后，再电转入N315，通过温度筛选，获得了dapB基因突变菌株，成功的敲除了dapB基因。提示pYZ1和pYZ8

6、能够成功用于金黄色葡萄球菌耐药菌株基因的敲除，为进一步研究临床金黄色葡萄球菌分离株耐药性及毒力提供了工具。卫玮，李晓玲，袁文常.金黄色葡萄球菌基因敲除质粒的构建及应用[J].中国组织工程研究，2015，19(5):799-804.ConstructionandapplicationofStaphylococcusaureusgeneknockoutplasmidWeiWei,Technician-in-charge,WeiWei,LiXiao-ling,YuanWen-chang(ClinicalLaboratoryDiagno

7、sticCenter,UrumqiGeneralHospitalofClinicalLaboratoryDiagnosticLanzhouMilitaryAreaCommandofChinesePLA,Urumqi830000,XinjiangUygurAutonomousRegion,Center,UrumqiGeneralChina)HospitalofLanzhouMilitaryAreaCommandofChinesePLA,Urumqi830000,XinjiangAbstractUygurAutonomousRegi

8、on,BACKGROUND:Methicillin-resistantStaphylococcusaureushasbeenaprimarypathogenofnosocomialChinainfectionsworldwide.Toconstructaquic