新无标记基因敲除系统的构建

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1、新无标记基因敲除系统的构建原理是：引入分枝杆菌噬菌体高效同源重组蛋內che9c60和61，以加强分枝杆菌发生.同源重组的能力；引入Xer剪切重组系统，用于切除抗性标记基因，以实现无抗性基因引入；che9c60、61蛋白在提高分枝杆菌的同源重组效率的同时会毒害分枝杆菌的生长，为此我们设计了条件可按表达系统一一四环素诱导可按表达系统。Xer剪切重组系统的工作机理是：分枝杆菌自身具有的Xer内源重组酶能够识别28bp的dif位点，并切除其含的基因，将抗性基因两端连接上dif序列，即可用于切除抗性标记基因。四环素诱导可控表达系统的工作机理是：使che9c60、61蛋白表达受tetO启动子

2、控制，在未加诱导剂时tetO启动子受tetR阻遏蛋白抑制，从而阻止che9c60、61蛋白的表达，降低che9c60、61蛋白对菌体毒害，当加入诱导剂——脱水四环素，tetR阻遏蛋白则结合四环素分子,tetR从tetO启动子上脱落，从而使重组蛋白gp60和gp61得到表达。为了工作方便起见，我们采用二元质粒体系，pFQ作为helper质粒用于条件衷达che9c60、61蛋白，pFQ-xei•则用于基因打靶和抗生删除。6.3实验方法6.3.1提高同源重组效率的pFQ质粒构建质粒pFQ构建流程如图6.1所示。6.3.1.1Pimyc-tetR阻遏蛋白和Che9cgp60-61重组蛋白

3、基因钓取依据6.2.6所设计的引物，运用PCR分别扩增出Pimyc-tetR和Che9cgp60-61目的基因。目的基因结构示意图6.2所示。6.3.1.2pFQ质粒的构建参照图6.1的pFQ质粒构建流程图，依次Pimyc-tetR、Che9cgp60-61和pSElOO质粒进行扣应醜切、纯化、连接、转化DH5a大肠杆謝验证等分子生物学操作，将它们依次整合，完成对pFQ质粒的构建。pSElOO质粒线性结构如图6.3所示，完整的pFQ质粒如图6.4。'chek«4l/IH»CU

4、单酶切T4ligaseBspUO-I(It)Ti£r«i^a-Ktndnid)/che9c-60dIAniLPim'chm：!wO少’hi图6.1pFQ劢粒构建流程示意围1ig6.111oudiagramoftheconstructionofplasmidplrQVtlM.vaA4>114^20Jr>4>*>(a)(b)图6.2HmyolclK和Chr9c«

5、)6«-6I基因结构图Fig,6,2t>iagramsofGenePimyc-tetRandC’he9cgp60-6I(u)表示Pimyv-lelK阻退蛋白基因t(b)表不chc9cgp60-61重组蛋白基因TIG32终止子

6、(47幻Pmvc1-tetO一hy§HindIII(430)pselOO553S图6.3pSElOO质粒线性结构示意图Fig.6.3LinearstructureoftheplasmidpSElOO6.4pFQ质粒图谱PMFig.6.4PlasmidmapofpFQpFQ-xer质粒片段的构建流程示意擇相⑴双醜切T4ligase■—■：■■■图6.5pFQ^Xer质粒构建流程示意图Fig.6.5FlowdiagramoftheconstructionofplasmidpFQ-Xer6.3.2.1dif+kan抗性基因和Hsp60启动子基因的钓取依据6.2.6所设计的引物，运用PC

7、R分别扩增出dif+kan和Hsp60启动子目的基因。基因结构示意图如下：dif^Ranhsp60图6.6(lif+kan和Ksp6()基因结构图lig.6.6DiagramsoIGenedif+kanandIIsp6()(a)表示dif+lcm抗性基因；(h)表示IkpfiO启动子基因参照图6.1的PFQ质粒构逮流程图，将dif+kan、Hsp60启动子进行相应酶切、纯化、连接、转化DH5a大肠杆菌验证等分子生物学操作，将它们连接整合，完成对pFQ-Xer质粒的构建。pFQ-Xer质粒如图6.4。图6.7pFQ-Xer质粒图谦Fig.6.7PlasmidmapofpiQ6.3.

8、3同源组片段的构建同源重组片段构建流程如图6.8所示。图6.8同源重组片段构建流程示意图6.3.3.1kstR3同源臂构建丁•puc-19T载体上首先先将上游同源臂kstR3-up和下游同源臂kstR3-Down分别插入至puc-19T通用质粒载体上，获得kstR3-up+puc-19T和kstR3-Down+puc-19T重组质粒并完成电泳验证和测序验证。而后，选用Pstl和Hindm双酶切上述获得的重组质粒，酶切产物纯化后，利用FermentasT4ligase进行连接，获得