DNA甲基化研究技术及应用

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1、DNA甲基化研究技术及其应用欧易生物主要内容•DNA甲基化介绍•甲基化检测方法•研究进展什么是表观遗传学？•表观遗传学：–基因序列无变化–基因功能发生变化–可遗传并且是可逆的•表观遗传学机制：–DNA甲基化–组蛋白修饰–RNAi3DNA甲基化•真核生物中，胞嘧啶被甲基化•DNA甲基化：在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMTs)的作用下，将一个甲基添加的胞嘧啶的5’-碳分子上，形成5-甲基化胞嘧啶(5-methylcytosine)SAH：S-adenosylhomocysteineSAM：S-adenosylmethionine4•修饰过程可

2、逆：胞嘧啶甲基化后产生5-甲基化胞嘧啶能够自发的脱氨基形成胸腺嘧啶(Thymine)：5mC->T•DNA甲基化的分布：转座子逆转录病毒衍生的重复序列大多数功能基因的编码区•DNA甲基化的模式：–线虫：无甲基化的胞嘧啶–果蝇：极少量的甲基化胞嘧啶，识别模式CpT(主要)vs.CpG(极少)–哺乳动物：CpG(~70%)或者CpNpG•CpG–CytosinephosphateGuanineCpG岛•CpG岛：富含CpG区域，长度500~2000bp，GC含量超过55%•低出现几率：大约1CG/100核苷酸•非随机出现：CpG岛多位于启动子区域或第一个外显子区–~60%

3、的编码基因的启动子区域含有CpG岛•CpG岛通常不被甲基化DNA甲基化功能•宿主防御模型(TheHostDefenceModel)•基因调控模型(TheGeneRegulationModel)宿主防御模型•转座子的甲基化•人类基因组~45%的区域是转座子•高度甲基化，细胞中90%的甲基化CpG位于转座子中•转座子的活性：对机体非常有害•宿主防御模型：抑制转座子的活性基因调控模型•DNA甲基化的主要功能：转录沉默(silencingtranscription)–基因的启动子区域通常不被甲基化修饰–建立特定的基因表达模式：组织特异性、生殖特异性…–基因印记、X染色体失活•DNA

4、甲基化抑制基因转录的机制：–干扰转录因子对DNA元件的识别和结合–将转录因子的DNA识别序列转变为阻抑物的识别序列–DNA甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子•DNA甲基化：是转录沉默的结果和维持，而不是原因长期沉默直接干扰间接干扰•Themethyl-CpGbindingproteinsMeCP1andMeCP2能够与甲基化的DNA结合•MeCP2能够招募Sin3a,HDACs，形成复合物，阻遏转录FromEstellerMetal.,2007,NatRevGenet,8:286-298甲基化与肿瘤发生15DNA甲基化研究领域•基础研究癌症发育生物学干细胞分化•医药DNA

5、甲基化转移酶抑制剂5-aza-deoxycytidine(AzadC)-HDACinhibitorsZebularine•临床诊断检测肿瘤早期检测肿瘤分类、分级16甲基化检测DNA甲基化的检测大体分为两个步骤：a．待检测样品的前期处理；b．目标序列的定位和甲基化状态的量化。甲基化的前期处理•重亚硫酸盐修饰•甲基化特异性内切酶•蛋白或抗体富集重亚硫酸盐修饰19甲基化特异性内切酶蛋白或抗体富集甲基化研究技术全基因组甲基化分析•甲基化芯片•甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)•亚硫酸氢盐处理测序(BisulfiteSequencing）23甲基化芯片1--亚硫酸盐修饰CH3

6、ggggagCagCatggagCCttCGgCtgaCtggCGtggCCatopstrandCCCCtCgtCgtaCCtCggaaGCCgaCtgaCCGCaCCggtbottomstrandCH3亚硫酸盐转化CH3ggggagUagUatggagUUttCGgUtgaUtggUGtggUUatopstrandUUUUtUgtUgtaUUTUggaaGCUgaUtgaUUGUaUUggtbottomstrandCH3处理后上下链不再互补针对转化后的序列设计芯片探针24Illumina甲基化芯片SpecificProbe(50basent)BeadIdentifie

7、r(30basent)微珠HiScanSQ25Infinium技术检测甲基化--单碱基延伸原理26HumanMethylation27K•>27，578个CpG位点•涵盖了14，475个RefSeq基因，注释过的基因12，833个•144个已经确认的癌症基因的甲基化位点,982个文献报道过的癌相关基因的位点•200个存在于CpG岛上•110个探针分布于miRNA启动子区域28HumanMethylation450K>450,000个CpG位点覆盖基因区域和CpG岛区域29HumanMethylation450K•>