根系活力的测定

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1、根系活力的测定（TTC法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水本。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。    一、原理    氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以

2、TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。    二、材料、设备仪器及试剂    （一）材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。    （二）仪器设备：1.分光光度计；2.分析天平（感量0.1mg）；3.电子顶载天平（感量0.1g）；4.温箱；5.研钵；6.三角瓶50ml；7.漏斗；8.量筒100ml；9.吸量管10ml；10.刻度试管10ml；11.试管架；12.容量瓶10ml；13.药勺；14.石英砂适量；15.烧杯10ml、1000ml。    （三）试剂：1.乙酸乙酯（分析纯）。2.次硫酸钠（Na2S2O4）

3、，分析纯，粉末。3.1％TTC溶液　准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。4.磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）。5.1mol/L硫酸　用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6.0.4mol/L琥珀酸　称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。    三、实验步骤    （1）TTC标准曲线的制作　取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。

4、再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再

5、加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。    四、结果计算    四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)]植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定（实验测试用）原理：过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器

6、官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。仪器：电子天平；冰冻高速离心机；可见光分光光度计；电动玻璃匀浆剂等。试剂：20mMKH2PO4；100mMPBS：取0.2MNa2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。反应液：取100mMPBS50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。方法：1.酶液制备：取1.0g植物叶

7、片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mMKH2PO45ml进行冰浴研磨提取。匀浆液低温离心8500rpm15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。2.酶活性测定：取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。3.计算：以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重

8、）。过氧化氢酶测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。    一、原理：过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消