高效液相流动相缓冲盐选择

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1、下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势，但是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶剂是一个很好的选择，因为不同的溶

2、剂可提供不同的选择性。在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH2~4的条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性，所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。当待分析物pKa或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH（如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液），可提供最好结果。对流动相的优化主要体现在

3、水相上。流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式，根据待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。（1）酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值±1pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为4.8，缓冲范围为pH3.8~5.8。（2）碱性化合物，在高pH条件下才能得到其非离子形态，但这对色谱柱不利。通常许多

4、碱性化合物在低pH条件的保留就已经满足要求了，所以可选择低pH条件。如果选择高pH条件，则注意需选择耐强碱的色谱柱。水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变pH值、改善峰形、提高分离度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时，低波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸。开发液相分析方法时流动相可首选0.1%的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时候再考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，还有醋酸盐，常用的

5、盐浓度在10~20mM左右（根据实际情况，有时可以选择更低或更高浓度，建议最高浓度不超过50mM）。下表是Waters提供的一个资料，常规实验室建议使用的缓冲盐体系。缓冲盐/流动相改性剂pKa缓冲范围挥发性？(±1pH)是否MS兼容？备注TFA0.3-是是离子对试剂，能够抑制MS信号，通常使用的浓度范围0.02~0.1%乙酸4.76-是是同乙酸铵一起使用具有最大的缓冲能力，通常使用的浓度范围0.1~1.0%甲酸3.75-是是同甲酸铵一起使用具有最大的缓冲能力，通常使用的浓度范围0.1~1.0%乙酸盐（铵盐）4.763.76~5.76是是通常使用1~10mM浓度，

6、注意钾盐和钠盐是非挥发性的甲酸盐（铵盐）3.752.75~4.75是是通常使用1~10mM浓度，注意钾盐和钠盐是非挥发性的磷酸盐12.151.15~3.15否否传统的低pH缓冲体系，UV透光度很好磷酸盐27.26.2~8.2否否当pH超过7时，降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命磷酸盐312.311.3~13.3否否当pH超过8时，降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命4-甲基吗啡啉~8.47.4~9.4是是通常使用浓度为10mM或更少氨水9.28.2~10.2是是通常使用浓度为碳酸氢铵10.3(HCO3-)9.2(NH4+

7、)8.2~11.35~10mM（用于MS工作时保持离子源温度超过150℃）。用氨水或乙酸调节pH值，在pH10时具有很好的缓冲能力。乙酸铵9.28.2~10.2是是通常使用浓度为1~10mM甲酸铵9.28.2~10.2是是通常使用浓度为1~10mM硼酸9.28.2~10.2否否降低温度，减少浓度并使用色谱柱来延长柱寿命CAPSO（3-环己胺基-2-羟基丙磺酸9.78.7~10.7否否两性离子缓冲液，同乙腈互溶，通常使用浓度为1~10mM，气味小Glycine甘氨酸2.4,9.88.8~10.8否否两性离子缓冲液，比使用硼酸盐对柱子的损伤更小些1-甲基哌啶10.2

8、9.3~11.3是是通常