ISSR分子标记及其在果树遗传学的应用

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1、福建农林大学研究生课程考试卷授课时间2012—2013学年度第一学期学　　　号：___________________研究生姓名：___________________课程名称：__果树遗传学__考试时间：__2012.12.25____考生成绩：___________________授课或主考教师：_________________（签章）ISSR分子标记及其在果树遗传学的应用摘要：ISSR分子标记是在SSR分子标记基础上发展起来的一种DNA多态性检测技术。它是DNA分子标记技术的一种，已在果树遗传育种研究的各个方面得到广泛的应用。ISSR标记符合孟德尔式遗传规律，具有简便、快速、

2、稳定、DNA多态性高等优点。本文主要介绍了ISSR分子标记在果树遗传多样性、种质资源鉴定和亲缘关系分析、遗传连锁图谱的构建等研究的应用。关键词：分子标记；ISSR；果树；遗传20世纪90年代以来，由于PCR技术的出现，基于PCR技术的DNA分子标记，如随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、简单重复序列(simplesequencerepeat，SSR)或称微卫星(microsatellite)、扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)等受到广泛重视和应用[1]。但RA

3、PD重复性低,AFLP费用昂贵,SSR引物设计费时耗力,使得它们的应用受到一定程度的限制。近几年，人们基于SSR分子标记基础上发展了一种新的分子标记，即锚定简单重复序列（anchoredsimplesequencerepeat，ASSR），也称作简单重复间序列(inter-simplesequencerepeat，ISSR)标记技术或以微卫星为引物的PCR(microsatelliteprimedPCR,MP-PCR)[2]。它是由加拿大蒙特里尔大学的Zietkiewicz等1994年提出的[3]。该技术以加锚SSR寡聚核苷酸作引物，对位于反向排列的SSR之间的DNA序列进行PCR扩

4、增，而不是扩增SSR本身，它在引物设计上比SSR技术简单得多，不需知道DNA序列即可用引物进行扩增，又可以揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多态性，现已在遗传多样性、种植资源鉴定、遗传连锁图谱的构建、基因定位、系统发育等方面被广泛应用，本文主要对ISSR分子标记技术的原理、操作及其在果树遗传、进化等领域的应用作简要介绍。1ISSR分子标记技术的基本原理和特点1.1ISSR分子标记技术的原理在真核生物基因组中均存在着由1～4个核苷酸组成的简单重复序列[4]，如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因组中最多的SSR是(AT)n、(TA)n、(GA)n、(CT)

5、n等二核苷酸重复序列[5]。ISSR技术的基本原理就是在SSR的3＇或5＇端锚定1～4个嘌呤或嘧啶碱基,然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR间的一段DNA进行PCR扩增,而不是扩增SSR本身。如图1-1。5′锚定引物NNNN(CA)n3′锚定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5′锚定引物NNNN(CA)n3′锚定引物NN(CA)n3′锚定引物的PCR产物5′锚定引物的PCR产物图1-1用重复序列(CA)n作单引物，在引物的5′端或

6、3′锚定1至数个碱基1.2ISSR分子标记技术的特点ISSR分子标记技术是一种在PCR中直接使用微卫星序列进行DNA扩增的分子标记技术。它具有以下特点:(1)实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐的构建基因文库、杂交和同位素示踪等操作，DNA用量少,引物设计容易,实验成本低廉。(2)扩增基因组DNA，适应于任何富含SSR重复单元和SSR广泛分布的物种，可同时提供多位点信息和揭示不同微卫星座位个体变异的信息。(3)ISSR分子标记为显性标记,符合孟德尔式遗传规律[6]。(4)遗传多态性好，重复性好。引物较长,通常为16～25bp,而RAPD的引物只有10bp；PCR扩增时的退火温度较高，

7、因此引物具有更强的专一性，与模板结合的强度提高，降低了杂带的干扰，提高了实验结果的可复性。但ISSR分子标记技术也有不足之处，其不足之处在于：PCR扩增反应的最适条件需要一定时间的摸索；ISSR标记大多为显性遗传标记,不能区分显性纯合基因型和杂合基因型。2ISSR分子标记技术实验操作[7]ISSR分子技术也主要包括DNA样品的提取、PCR扩增、电泳检测、观察结果及统计分析等步骤。2.1DNA样品的提取提取植物DNA的方法有很多，用于ISSR分子标记的DNA