如何正确设计技术路线、实施方案

《如何正确设计技术路线、实施方案》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、如何正确设计从生物样品中分离纯化生物大分子的技术路线和正确实施设计方案一、通用的技术路线设计方案：1、确定要分离提纯的生物大分子的目的和要求不论是学生学习简单的分离提纯方法，还是科研人员进行研究、开发或者探索新物质，一个明确的目的和要求都是必不可少的。本课题要求对生物大分子进行分离提纯，也即在了解生物大分子（即蛋白质、核酸、脂质、糖类）的前提下，进行尽可能完善的提纯，同时也应注意满足现实设备情况。2、建立相应可靠的分析测定方法分离提纯最为重要的就是最终的“纯度”，所以一套完善可靠地分析测定方法就是进行工作的前提条件。

2、没有这双“眼睛”，将无法得到最终的实验结果。3、查阅文献调研和预备性实验要进行分离提纯就必须掌握四种生物大分子的一般理化性质以及需要提纯的产物的一些特殊理化性质，只有这样才能进行分离提纯的工作。4、生物材料的破碎和处理需要分离的生物大分子往往贮存在生物体内，而根据生物种类的不同，如微生物、动物、植物等，有不同的生物材料处理方式，而处理方式的得当与否，往往也决定着最终的提取率的高低甚至实验的可行性。5、分离纯化方案的选择和探索同样的一类物质往往有很多种方案可以进行分离提纯，但如何根据所需生物大分子的种类、它所处的生物环

3、境、客观因素等种种条件来选择最好的一种分离纯化方式，是整个实验最为困难的步骤。而在一些尖端领域，甚至需要研究人员自行探索新的方案，这无疑又大大加大了这一步的难度。所以可以说，这一步是整个实验过程中最为困难的一步，也应是投入精力最多、选择最仔细的一步。6、生物大分子纯度的检测根据提纯的生物大分子种类不同，选用相应的检测方式进行检测。7、产物的浓缩、干燥与保存二、常用的检测方法：1、物理、化学方法：比色法、气相/液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。但应注意，必须同时采用2～3

4、种不同的纯度鉴定法才能确定。2、生物学的测定法：酶活测定、蛋白质含量测定、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；三、要了解的主要理化性质：1、在水和各种有机溶剂中的溶解性。2、在不同温度、pH值和各种缓冲液中蛋白质大分子的稳定性。3、态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。4、物理性质：分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。5、化学性质：对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。6、对其他生物分子的特殊亲和力等。一、每种生物大分子进行分离提纯的

5、技术路线要点1、核酸的分离提纯（1）核酸分离纯化的原则：l保持核酸分子一级结构的完整性Ø意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。Ø具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9);保持一定离子强度;减少物理因素对核酸的机械剪切力。l防止核酸生物降解ØDNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂ØRNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物（2）核酸分离纯化的步骤：l取材：核酸在细

6、胞内部，所以需要破碎细胞才能取得核酸，常用方法如下：高速组织捣碎机捣碎；玻璃匀浆器匀浆；超声波处理法；液氮研磨法；化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）；生化法（溶菌酶、纤维素酶等）。l除杂：Ø肝糖元、淀粉及粘多糖：取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死；加入淀粉酶；在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液；以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA。Ø蛋白质的除去：加入去污剂如SDS；氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提；苯酚水溶液抽提；加入浓盐溶

7、液如NaCl。Ø不同类型核酸的分离：（1）从DNA中除去RNA：核糖核酸酸酶选择地破坏RNA；钙盐分步沉淀；活性炭吸附。（2）从RNA中除去DNA：苯酚水溶液抽提；加入脱氧核糖核酸酶处理。Ø同类核酸的分离：（1）RNA混合物的分离：多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。（2）DNA混合物的分离：常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析，逆流分溶，梯度离心等方法。l浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。常用方法如下：Ø盐溶

8、液沉淀：如MgCl2；；NaAc；KAc等。Ø有机溶剂沉淀：如乙醇；异丙醇；聚乙二醇（PEG）；精胺等。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。l测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法测定核酸的含量。l保存：对DNA和RNA有不同的保存方式：Ø对DNA：DNA样