荧光定量PCR仪的分析及应用

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1、从提取到定量,Ph.D.TechnicalProductSpecialistchenyd@appliedbiosystems.comAdvancingSciencefor25Years提要IABI简介II定量PCR仪器III定量PCR原理IV定量PCR实验：让定量PCR发挥更大作用提取和样品保管：6100，RNAlater特异的探针引物+通用的酶液：定量任何基因2Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsAppliedBiosy

2、stems1981年成立，总部位于美国加州旧金山FosterCity3Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsABI产品¢DNA产品线ò遗传分析仪（测序仪）：3130ò定量PCR仪：7500òPCR仪ò提取仪：6100ò合成仪ò蛋白相互作用：8200ò芯片仪：1700¢蛋白质产品线¢软件、试剂盒¢世界一流的技术支持4Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25Years定

3、量PCR仪三大功能绝对定量—测定RNA或者DNA的拷贝数相对定量—测定同一基因在不同样品间的比例等位基因鉴定—SNP测定、突变测定、物种鉴定5Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsII、ABI定量PCR仪第一代第二代第三代770057007000790073007500世界第一台6Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsABI定量PCR仪7500FastS

4、ystem7300快速System快速7900HTFastSystem7Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsAppliedBiosystems7300Real-TimePCRSystem8Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsAppliedBiosystems7500Real-TimePCRSystems在同一个反应管内同时检测5种荧光兼容2步法PCR

5、和3步法PCR能做熔解曲线7500FastReal-TimePCRSystem7500Real-TimePCRSystem9Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsAppliedBiosystems7900HTFastReal-TimePCRSystem10Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25Years7500数据质量：在同一个管内检测五色FAM™,VIC®,NE

6、DTM,CY5™&ROX™Cy5FAMNEDVIC11Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsIII、定量PCR原理¢探针法•TaqMan•TaqManMGB•双探针(Dual-oligoFRETpairs)•分子信标(Molecularbeacons)¢染料法•SYBRGreenI•PowerSYBRGreen12Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsT

7、aqMan探针结构5'3'RQ3'5'3'5'5'3'5'13Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25Years探针信号=DNA拷贝数forwardprimerRprobeQ5'3'3'5'5'3'R5'Qreverse1.退火，开始聚合5'3'primer3'5'5'3'5'2.遇到探针RQ5'3'3'5'RQ5'3'5'5'3.Taq酶的5’→3’外切活性3'5'5'3'3'5'R=报告基团Reporter4.聚合完成Q=淬灭基团Q

8、uencher14Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25Years只有1个碱基的差异，也要精确分辨FAMMGB完全配对，有信号FAMMGB一个碱基不配对，无信号15Nov2006©2006AppliedBiosystemsAdvancingSciencefor25YearsMGB探针(non-fluorescentquencher)NFQQRQAGGCCTTGAGAGATATMGB(minorgroovebinder)RAGGCCTT