福林酚法测蛋白

《福林酚法测蛋白》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应： (1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。 【仪器与用具】 试管若干；

2、刻度移液管05Ml1支，1Ml1支，10Ml1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管)；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。 【试剂】 NA2WO4·2H2O；NA2MoO4·2H2O；85％H3PO4；浓HCl；LI2SO4·H2O；溴水；酚酞指示剂；NA2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。 【方法】 1试剂的配制 (1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备首先配制A液：4％碳酸钠(NA2CO3)溶液与0.2Mol／L氢氧化钠(NAO

3、H)溶液等比例混合(2％NA2CO3，01MolNAOH)；B液：1％硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5％CuSO4·5H2O，0.1％酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。 酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(NA2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(NA2MoO4·2H2O)25g，加蒸馏水700Ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中。之后加入85％的H3PO450Ml，浓HCl100Ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡

4、铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10H。冷却后加入硫酸锂(LI2SO4·H2O)150g，水50Ml，溴水2～3滴，不用回流装置开口煮沸15Min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000Ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15Min)。使用时用标准NAOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1Mol／LH＋酸，此为FolIn－酚试剂乙液(FolIn试剂)。 在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生，

5、所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。 （2）标准蛋白质溶液的配制称取25mg牛血清白蛋白，溶于100Ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg／Ml。 2标准曲线的绘制 （1）取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1Ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。 (2)在每支试管中用定量加样器加入5Ml甲液，混匀，于30℃下放置10Min。 

6、(3)在每支试管中喷射加入0.5Ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30Min。 (4)准确到30Min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nM下用1CM光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。 以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3样品的测定 (1)样品的提取：称取鲜样05g，用5Ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。 取10Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。 (2)根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。 4结果计算 样品中蛋白的含

7、量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000(2-1） 式中C:查标准曲线值(μg)； VT:提取液总体积(Ml)； FW:样品鲜重(g)； V1:测定时加样量(Ml)。 【注意】 还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。http://www.cqxykgs.com/http://www.cdxyktxyh.com/http://a616141064.qqamq.com/http://www.tt0994.com/news/newsshow-151055.htmlPfYJJir22M60