iCycler iQ荧光定量PCR仪的操作说明

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1、iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作说明iCycleriQTMMulti-ColorRealTimePCRDetectionSystemOperatingInstructionsCatalogNumber170-8740如与英文版说明书有不符之处以英文版说明书为准12．iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统操作速成2.1简介：iCycleriQTM荧光实时多波长PCR检测系统可以最多一次检测96个样品，且每个样品中同时可以检测4个不同波长的荧光信号。也就是说，只要标记不同荧光探针，iCycler

2、可以对同一个孔中两种以上的PCR产物（最多四种）同时进行实时分析。这样对多重PCR反应或使用内对照（InternalControl）定量的PCR反应的检测就十分方便。在反应过程中，不同的荧光信号通过与其匹配的不同波长的滤光镜组来检测。比如，在一个反应管中同时有四种荧光探针共存，分别标记了FAM、HEX、®TMTexasRed和Cy5，在收集其荧光信号数据的时候，必须同时使用FAM滤光镜组、HEX滤光镜组、TexasRed滤光镜组和Cy5滤光镜组。所有的收集的信号由iCycler的软件进行分析整理，在PCR反应结束后，该软件可

3、以显示其各自的荧光曲线和标准曲线，并得到这四种荧光探针分别对应的靶DNA的定量结果。在每次使用iCycler进行PCR荧光定量实验之前，系统必须获得孔间差异因子（WellFactor）和纯染料校准（PureDyeCalibration）的数据。系统通过这些数据来区分不同的荧光信号，矫正孔间的误差。本章节将详细的介绍这两者的调节方法。您在使用本仪器前请先仔细阅读本章的内容，这将有助于您能够快速地完成实验并获得理想的实验数据。2.2：iCycler操作速成1.开机前先让摄象系统预热30分钟。接通iCycler的电源，并连上电脑，

4、打开iCycler的软件。如果本仪器在上次使用后被搬动过，请在RunTimeCentral模块中的ImagingService窗口检查遮光框的校正情况，详见6.2。2.如果要使用新的荧光染料/滤光镜组，必须进行一次纯染料校准（PureDyeCalibration），使系统获得相关数据，详见2.4。3.在96孔薄壁反应板（96-wellThinWallplate，产品序列号223-9441）内加入PCR反应试剂和待测样本。完成后在反应板上盖一块光学级封带（OpticalQualitysealingtape，产品序列号223-9

5、444），用封带涂抹器（塑料扁平齿）2将其涂抹光滑。注意，无论带不带手套，都不要让手指接触到封带表面。完成后撕去封条四周的白条。如果不用96孔薄壁PCR反应板，而是用单独的PCR反应管或八连管时，请在加完样品后盖上相匹配的盖子。注意，为防止放入iCycler的PCR反应管被压碎，在使用绿色抗凝环（greenanticondensationring）时至少放8个反应管；如果没有使用该环，则至少要加14个反应管。4.在ProtocolWorkshop模块中设置PCR热循环的程序（thermalprotocol），包括温度、时间、

6、循环次数等参数的设置。详见5.1。5.在ProtocolWorkshop模块中设置反应板设置文件（PlateSetup）。先创建一个新的反应板设置文件，再根据本次实验的所用的荧光染料选择其对应的滤光镜设置文件（FliterWheelSetupfile），详见5.2.5。最后，在设置窗口的96孔模拟布局图中选择本次实验使用哪些孔、样品类型（sampletype）以及要检测的荧光基团种类。如果样品类型是标准品的话，还要输入其对应的量。全部完成后再点击“ViewPlateSetup”键，进行确认。详见5.2。6.确认上一步中选择的

7、滤光镜组是否就位。详见5.2.5。7.如果实验需要使用孔间差异矫正板（externalwellfactorplate）进行系统孔间差异矫正的，先将该板放入iCycler；如果是使用反应板内部矫正的，直接将步骤3中准备好的PCR反应板放入iCycler。详见2.3。在ProtocolLibrary模块中“ViewProtocol”窗口选择PCR热循环文件；同样在该模块的“ViewPlateSetup”窗口选择反应板设置文件。完成后按“Run”键。8.随后系统自动切换到“RunPrep”窗口，用户在此确认PCR热循环文件和反应板

8、设置文件是否正确。在“Samplevolumeis”文件框中输入反应体系的体积；根据本次实验内容在“IdentifyProtocolAnalysis”中选择是PCR定量/熔点曲线（PCRQuantification/MeltCurve）还是纯染料校准（PureDyeCalibration）