粒细胞巨噬细胞刺激因子新剂型研究

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1、河北医科大学硕士学位论文重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子新剂型研究姓名：梁倩申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：曹德英20090301中文摘要重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子新剂型研究摘要目的：重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(Recombinanthumangranulocyte—macrophagestimulatingfactor，rhGM—CSF)是由骨髓分化而成，并可由骨髓前提细胞分离得到，它是一种非糖基化的水溶性蛋白质，由127个氨基酸组成。rhGM．CSF的主要作用是对粒细胞系和单核细胞系细胞的维持

2、存活、促进生长、诱导分化和增强功能等。基于临床研究的应用中发现rhGM．CSF应用于烫伤、烧伤等疾病领域，并显示了良好的疗效。目前，临床上主要采用注射剂含漱等治疗途径，考虑到局部外用治疗，并保证安全、有效、稳定、使用方便的前提，本课题研制了rhGM．CSF外用溶液剂型，主要用于皮肤的烫伤、烧伤等疾病。它可直接作用于患病部位，从而避免肝脏的首过效应和胃肠道的降解反应及有关的副作用，携带使用方便。方法：本实验选择重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子发酵液作为提取材料，在预试验的基础上初步确定重组人粒细胞巨噬细胞刺激因

3、子的制备方法。将大肠杆菌表达的rhGM．CSF经过超声波破碎后收集包涵体，通过包涵体的变性和复性操作得到粗提的蛋白质，通过层析步骤得到提纯的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子原液。rhGM，CSF外用溶液处方设计与筛选试验分别考察了中文摘要pH筛选，稳定剂的筛选，透皮吸收促进剂的筛选。为了考察pH值对rhGM．CSF外用溶液．的生物活性的影响，在处方中其他成分用量固定的前提下，将不同用量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠对试验样品pH值的影响。本试验选择不同的稳定剂加入到制剂当中，HT．、DB．、TG．和GT．，通过25

4、±2℃加速试验，以选择最佳的保护剂。确定保护剂后，在其他组分固定的情况下，将保护剂按照不同比例，加到样品当中，通过25+2。C}JH速30天，最终确定处方用量。本试验选择TW．、BZ．、SD．作为参考，通过25+2℃加速试验来考察它们对于制剂稳定性的影响。最后确定了rhGM．CSF外用溶液的最佳处方。处方确定后进行稳定性考察，制备了三批GM—CSF制剂样品，置于40+2℃，254-2℃，2～10℃三种条件下放置，以考察任何rhGM．CSF外用溶液样品的外观、pH值、生物活性、无菌检查等方面的变化情况。结合

5、《中国药典》中rhGM．CSF产品的要求及通则中对外用溶液产品的要求，制订了GM．CSF外用溶液的质检规程草案。分别对样品外观、pH值、效价测定、蛋白含量测定、装量、无菌等方面进行了研究。rhGM．CSF外用溶液治疗烧伤的药效试验：选用家兔为试验模型，构建浅II度烧伤实验模型，随机分组，分别涂抹rhGM—CSF外用溶液(70txg／ml、35lag／ml、15吲m1)、rhGM．CSF原液(35gg／m1)、外用溶液空白溶液、生理盐水，每次涂抹3下，每次涂抹共约0．4ml，每天定时给2次，连续7天。，rh

6、GM．CSF外用溶液用于治疗烫伤的药效学实验，选用中文摘要家兔为试验模型，构建烫伤模型，随机分组，每只家兔的六处创面分别给予的药物为：rhGM．CSF外用溶液70“∥ml、35gg／ml、15gg／ml、rhGM—CSF原液35pg／ml、外用溶液空白溶液、生理盐水。每次涂抹3下，每次涂抹共约0．4ml，每天定时给2次，连续7天。rhGM．CSF外用溶液对动物皮肤急性毒性试验，观察rhGM．CSF外用溶液对家兔完整皮肤及破损皮肤短期接触所产生的毒性反应。急性毒性试验和资料，是对药物一次性给予大剂量的安全性

7、考察，按照皮肤急性毒性的试验要求，受试药物剂量超过有效浓度的20倍时，仍未出现异常反映或死亡，即可提示药物的安全性。参考药效试验中的高剂量70¨∥ml，此实验设计了1．4mg／ml。rhGM．CSF外用溶液刺激性研究，试验包括皮肤过敏试验和皮肤刺激试验。实验动物为豚鼠，按体重性别随机均分组，每组5只雌雄各半。通过动物皮肤接触受试物后，观察机体免疫系统反应在皮肤上的表现或观察药物对家兔皮肤多次给药所产生的刺激反应。结果：按照试验设计从发酵液中提取rhGM．CSF原液。在筛方试验中将不同pH值的试验样品通过2

8、5+2℃加速30天，实验结果显示，磷酸氢二钠的用量为299／L，磷酸二氢钠的用量为2．ogm时，样品pH值约为7．2，此时对rhGM．CSF外用溶液的生物活性影响小。通过25=t=2℃加速试验，选择最佳的保护剂为HZT．。在其他组分固定的情况下，将HZT．按不同比例，加到样品当中，通过25+2。C))H速30天，实验结果显示，HZT．用量为3009时，活性损失最小，当其浓度再增加时，就会导致样品溶液中文摘要粘度增加，最终确定处