昆明爱科特生物科技有限公司β甘露聚糖酶

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1、昆明爱科特生物科技有限公司β-甘露聚糖酶酶活力测定方法β-甘露聚糖酶酶活力的测定（DNS法）1β-甘露聚糖酶酶活力单位定义在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟催化浓度为9mg/mL的甘露聚糖溶液生成1μmol甘露糖所需的酶量定义为一个β-甘露聚糖酶酶活力单位IU。2测定原理β-甘露聚糖酶可将甘露聚糖水解为寡糖和单糖。含有游离醛基或酮基的寡糖和单糖在碱性沸水浴的条件下与3，5—二硝基水杨酸反应生成橘红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。该化合物在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系。而反应液中还原糖（以D-甘露糖计）的生成量又与β-甘露聚糖酶的酶

2、活力成线性关系。因此，可通过分光比色法测定反应液的光吸收值，利用标准曲线方程来计算反应液中还原糖的含量，进而反映出β-甘露聚糖酶的酶活力。3仪器与设备3.1实验室用样品粉碎机或研钵。3.2分样筛孔径为0.25mm（60目）。3.3分析天平感量0.001g。3.4pH计精确至0.01。3.5磁力搅拌器（带有加热功能）3.6涡旋混合器3.7烧结玻璃过滤器孔径为0.45μm。3.8恒温水浴锅精度为0.1℃。3.9秒表每小时误差不超过5秒。3.10可见分光光度计1昆明爱科特生物科技有限公司β-甘露聚糖酶酶活力测定方法能检测350nm～800nm的吸光度范围。3.11离心机4000r/m

3、in3.12移液器精度为1μL。3.13可调压电炉3.14高压灭菌锅3.15冰箱3.16耐高温玻璃器皿4试剂与溶液除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水为去离子水。4.1乙酸（CH3COOH）溶液，浓度为0.1mol/L（1）在250mL烧杯中加入80mL去离子水。（2）精确吸取0.60mL冰乙酸于烧杯中。（3）用去离子水定容至100mL。4.2乙酸钠(CH3COOH·3H2O)溶液，浓度为0.1mol/L（1）在250mL烧杯中加入80mL去离子水。（2）加入1.36g三水乙酸钠于烧杯中，搅拌溶解。（3）用去离子水定容至100mL。4.30.1mol/L，pH5.5的乙酸-乙

4、酸钠缓冲液（1）在1000mL烧杯中加入800mL去离子水。（2）加入11.57g三水乙酸钠和0.85mL冰乙酸于烧杯中，搅拌溶解。（3）测定溶液的pH，若pH偏离5.5，用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5。（4）用去离子水定容至1000mL。（5）室温储存，用前要检查pH。若要长期储存，需加入0.2%的叠氮化钠来防止微生物生长变质。4.41mol/L，pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（1）在250mL烧杯中加入80mL去离子水。（2）加入13.608g三水乙酸钠于烧杯中，搅拌溶解。2昆明爱科特生物科技有限公司β-甘露聚糖酶酶活力测定方法（3）用冰乙酸调pH至5.5。（4）用去离

5、子水定容至100mL。（5）室温储存，用前要检查pH。4.5D-甘露糖（C6H12O6）储备液，浓度为10mg/mL（1）称取1.000g无水D-甘露糖于100mL容量瓶中。（2）用0.1mol/L，pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至100mL。4.6D-甘露糖（C6H12O6）标准液，浓度为1mg/mL（1）吸取10mLD-甘露糖储备液于100mL容量瓶中。（2）用0.1mol/L，pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100mL。4.71%（w/v）甘露聚糖溶液（1）打开磁力搅拌加热器。（2）在250mL耐高温高压三角瓶中准确加入90mL去离子水，同时加入一个磁力搅拌

6、子。（3）加热至约60℃。（4）称取1.000g甘露聚糖（SigmaG0753）。（5）边搅拌边将甘露聚糖全部加入热水中，在加入过程中不可形成团块。（6）将三角瓶放入高压灭菌锅中，在121℃条件下加热20min。（7）加热完毕，取出，迅速冷却至室温，（8）加入10mL1mol/L，pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，在磁力搅拌器上继续搅拌10min。（9）在离心机（4000r/min）中离心5min（10）上清液—甘露聚糖溶液能立即使用，每次取时要摇匀。（11）4℃避光保存，有效期为3天。4.8DNS试剂（1）称取20gNaOH于1000mL棕色广口瓶中。（2）加入500mL去离子

7、水。（3）边搅拌边溶解，同时边加入6.30g3，5—二硝基水杨酸，不断搅拌直到溶液清澈透明（注意：整个溶解过程溶液温度不可超过48℃）。（4）边搅拌边依次加入四水酒石酸钾钠182.0g，苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，3昆明爱科特生物科技有限公司β-甘露聚糖酶酶活力测定方法同时补加水150mL，不断搅拌直到溶液清澈透明（注意：整个溶解过程溶液温度不可超过48℃）。（5）冷却至室温，用去离子水定容至1000mL，贮于棕色瓶中避光静置7天。（6）用烧结玻璃过滤器过滤即可使用，滤液储存在棕色试