酶反应动力学技术研究

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1、酶反应动力学技术研究食品工程学院08级生物工程（一班）孟昭旸酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度。酶促反应动力学是研究酶促反应速率及其影响因素的科学。这些因素包括酶浓度、底物浓度、pH值、温度、激活剂和抑制剂等。在实际生产中要充分发挥酶的催化作用，以较低的成本生产出较高质量的产品，就必须准确把握酶促反应的条件。底物浓度对反应速度的影响看底物对酶促反应的饱和现象，由实验观察到，在酶浓度不变时，不同

2、的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度的增加与底物浓度的增加成正比（一级反应）；此后，随底物浓度的增加，反应速度的增加量逐渐减少（混合级反应）；最后，当底物浓度增加到一定量时，反应速度达到一最大值，不再随底物浓度的增加而增加（零级反应）。米氏方程及米氏常数根据上述实验结果，Michaelis&Menten于1913年推导出了上述矩形双曲线的数学表达式，即米氏方程：ν=Vmax[S]/(Km+[S])。其中，Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数关于Km和Vmax的意义有以下论述：①当ν=Vmax/

3、2时，Km=[S]。②当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。③Km可用于判断反应级数：当[S]<0.01Km时，ν=（Vmax/Km）[S]，反应为一级反应。当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应关于Km和Vmax的意义有以下论述：④Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。⑤Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，

4、Km值最小者，为该酶的最适底物关于Km和Vmax的意义有以下论述：⑥Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。⑦Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。酶的浓度对于反应速度的影响当反应系统中底物的浓度足够大时，酶促反应速度与酶浓度成正比，即ν=k[E]。其他因素对于酶促反应速度的影响一般来说，酶促反应速度随温度的增高而加快，但当温度增加达到某一点后，由于酶蛋白的

5、热变性作用，反应速度迅速下降观察pH对酶促反应速度的影响，通常为一钟形曲线，即pH过高或过低均可导致酶催化活性的下降。酶催化活性最高时溶液的pH值就称为酶的最适pH酶的抑制剂定义：凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质分类：不可逆抑制作用和可逆抑制作用。不可逆抑制作用定义：抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用。分类：酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。可逆抑制作用定义：抑制剂以非共

6、价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用。分类：竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。可逆抑制作用竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低特点：a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。可逆抑制作用反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物

7、结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低。特点：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数：Km减小，Vm降低。可逆抑制作用非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低。特点:a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低酶的激活剂定义：：Km值不变，Vm值降低。能够促使酶促反应速度加快的物质。酶的激活剂大多数是金属离子，如K

8、+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。举例1：草甘膦N-乙酰转移酶反应动力学研究酶反应动力学利用ThermoMULTISKANSPECTRUM酶标仪,通过连续分光光度分析法进行分析。将5μLGAT酶液加入到295μL的测活缓冲液(25mmol/L