基因工程制药工艺

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1、第三章基因工程制药工艺3.1基因工程制药微生物表达系统3.2基因工程大肠杆菌的构建技术3.3基因工程菌的发酵培养与控制3.4重组人干扰素生产工艺基因工程制药工程菌种类基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。基因工程制药工程菌种类3.1基因工程制药微生物表达系统3.1.1大肠杆菌表达系统3.1.1酵母表达系统基因工程制药工程菌种类3.1.1大肠杆菌表达系统1、大肠杆菌（Eschericliacoli）形态特征细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般

2、无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。基因工程制药工程菌种类2、生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。基因工程制药工程菌种类3、质粒载体复制起始点选择标记多克隆位点基因工程制药工程菌种类质粒类型∑严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几个拷贝的质粒，pSC101；∑松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百个拷贝数的质粒，pMB1和colE1。∑克隆质粒：用于克

3、隆和扩增外源基因。∑测序质粒：用于基因测序。∑整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合。∑穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在。∑表达质粒：能表达基因产物基因工程制药工程菌种类4、产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达:外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端附加蛋氨酸。胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外的培养液中。基因工程制药工程菌种类5、优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高达70％），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化

4、、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。基因工程制药工程菌种类6、应用∑大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。∑多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）∑激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种PEG化)∑细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗剂∑溶栓酶类：rPA∑白喉毒素-IL2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等。基因工程制药工程菌种类3.1.2酵母表达系统1、形态特征细

5、胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。基因工程制药工程菌种类2、生长与遗传特征孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞，进行芽殖。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2小时。酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因组测序，遗传背景已相当清楚。基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约6000个基因基因工程制药工程菌种类3、优点与不足五种类型的载体，——安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培

6、养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。基因工程制药工程菌种类4、应用1981年Hitzman等：酵母表达人干扰素∑激素类：6种人胰岛素及1种突变体，尿酸水解酶和水蛭素，细胞因子：GM-CSF和血小板衍生生长因子∑多肽类：高血糖素∑2种乙肝疫苗等。∑8种产品基因工程制药工程菌与构建小结∑表达系统：宿主菌+表达质粒∑生物学，生产特征∑大肠杆菌系统：∑酵母系统：基因工程制药思考题（1）分析比较基因工程大肠杆菌和酵母表达系统制药的

7、优缺点，如何选择应用？（2）这两个系统生产了哪些重组蛋白质药物？第三章基因工程制药工艺3.1基因工程制药微生物表达系统3.2基因工程大肠杆菌的构建技术3.3基因工程菌的发酵培养与控制3.4重组人干扰素生产工艺基因工程制药工程菌构建3.2基因工程大肠杆菌的构建技术3.2.1构建流程3.2.2表达载体构建3.2.3工程菌构建基因工程制药工程菌构建3.2.1工程菌构建流程目标基因克隆PCR，文库，化学合成表达载体构建酶切，连接遗传转化与筛选外源基因导入与培养工程菌基因工程制药工程菌构建3.2.2表达载体构建∑表达载体设计∑目标基因的定位克隆∑酶切反应∑连接反应∑转

8、化∑筛选与鉴定基因工程制药工程菌构建1、表达载体的设