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《PEGFPLOXPLOX2272 载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、农业生物技术学报，2011年，第19卷，第4期，第711~718页JournalofAgriculturalBiotechnology,2011,Vol.19,No.4,711~718研究报告ALetter pEGFPloxPLox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化1，222222221*王帅赵学明朱化彬杜卫华郝海生王栋刘岩秦彤王宗礼1甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070；2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193*通讯作者，wangzongli@sina.com摘要绿色荧光
2、蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记，将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y 染色体上是利用GFP分选X和Y 精子的关键。本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和TM Lox2272位点引入pEGFPN3 载体中，构建了重组质粒pEGFPloxpLox2272。采用Lipofectamine(Lip)2000介导线性化质粒pEGFPloxpLox2272转染牛胎儿成纤维细胞，结果显示，在质粒用量一定的情况下30滋LLip2000 转染细胞的效果最理想；转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418 筛选，结果
3、显示，浓度为600滋g/mL的G418最适合筛选转基因细胞。本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考。关键词绿色荧光蛋白，阳性细胞筛选，基因打靶，载体构建ConstructionofaVectorpEGFPloxpLox2272andOptimizationofProcedure forSelectingTransgenicBovineFetalFibroblasts 1,22222222WangShuai ZhaoXueming ZhuHuabin DuW
4、eihuaHaoHaisheng WangDong LiuYan QinTong 1*WangZongli 1CollegeofAnimalScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China*Correspondingauthor,wangzongli@sina.co
5、mDOI:10.3969/j.issn.16747968.2011.04.017AbstractGreenfluorescentprotein(GFP)isanidealmarkerforcellsorting.Integratinggreenfluorescent protein(GFP)intobovineYchromosomeisthekeyforsortingXandYspermbyGFP.Inthisstudy,oneloxpsiteandoneLox2272sitewereinsertedintothe
6、vectorpEGPPN3throughspecialdesignedprimersamplifiedby highfidelityenzymeandthevectorpEGFPloxpLox2272wasconstructed.ThebovinefetalfibroblastswereTM transfectedwithlinearizedpEGFPloxpLox2272byLipofectamine (Lip)2000.Theresultsrevealedthatthebesttransfectedeffect
7、wasmediaedby3滋LLip2000andthebestconcentrationofG418forscreeningtransgeniccellcloneswas600滋g/mL.Thisstudyprovidsausefulmethodforconstructingvectorsandimportantreferenceforscreeningbovinegenetargetedcellclones.KeywordsGreenfluorescentprotein,Selectingtransgenicc
8、lonecells,Genetargeting,Vectorconstruction 提高奶牛后代中母犊的比率是一项对奶业生产于精液中X 精子和Y 精子之间缺少易于分选的标具有重要现实意义的工作，目前最有效的性别控制记，性控精液的分离速度很慢而且生产成本高昂，在技术是利用性控精液对母牛进行人工受精，但是由奶业生产中未得到广泛应用(Johnson,1995;D
