阿帕替尼通过下调VEGFR2-PLC-ERK12通路表达抑制胃癌细胞株MGC-803增殖

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1、前言近年来胃癌发病率和死亡率明显下降，但胃癌仍然是一个重要的公众健康问题。胃癌在中国的发病率居第2，死亡率居第3，是中国四大特色肿瘤之一。其中，晚期胃癌占60-80%，而现有治疗手段获益有限，5年生存率仅20%。有些无法切除、复发或转移性胃癌患者无法达到根治。最佳支持治疗（BSC）预后仅有几个月。对于转移性胃癌，现有资料显示，联合化疗虽然能够提高疾病的缓解率，提高患者生存率，但毒性较高。近些年来，多种靶向药物正在进行临床研究，如抗表皮细胞生长因子受体1（EGFR）和2（HER-2）单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制药和血管生成抑制药。这些靶向治疗是未来癌症治疗的趋势，也符合国家“精准医疗”的理

2、念。抑制肿瘤血管生成，是当今抗肿瘤治疗的热点。当肿瘤半径<2mm时，它主要依靠扩散在细胞周围的营养物质和氧气生存。随着瘤体的增大，肿瘤本身或宿主组织将建立起新生血管网已供给瘤体营养。阿帕替尼就是一种抑制肿瘤血管生成的新型靶向药物。它能高度选择性竞争细胞内VEGFR-2的ATP结合位点，阻断下游信号转导，抑制肿瘤组织新生血管生成。体外实验结果显示，阿帕替尼对胃癌细胞也具有一定杀伤力。目前已公布的阿帕替尼Ⅱ期临床试验数据，阿帕替尼组的结果具有较高统计学意义（P<0.001OS&PFS）其中阿帕替尼850mgqd组较安慰剂组中位生存期延长2.3个月，中位PFS延长2.3个月。近期公布的阿帕替

3、尼Ⅲ期临床试验结果显示，阿帕替尼组总生存期（OS）比安慰剂组延长1.8个月（medianOS6.5vs.4.7months,HR0.71,P=0.01），中位PFS也被显著延长（2.6vs.1.8months,HR0.44,P<0.001）。阿帕替尼的临床试验结果令人鼓舞。紫杉醇是一种抗微管药物，能特异性的结合到肿瘤细胞的微管β位上，使微管聚合成团块或束状，使其稳定性增加，从而抑制肿瘤细胞内微管网的正常重组，导致肿瘤细胞死亡。在各项研究中，紫杉醇单药治疗晚期胃癌的有效率17%～23%。早期Ⅱ期临床试验表明紫杉醇和其他药物无交叉耐药，也没有毒性相加或重叠。在RAINBOW研究中，紫杉醇与

4、另一种抗VEGFR2药物雷莫芦单抗联用，被证实要由于单用紫杉醇组，无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）明显延长，因此，抗VEGFR2靶向药物与紫杉醇联用，成为胃癌治疗领域一个重要的研究方向。目前阿帕替尼主要适用于接受过2种系统化疗后进展或复发的晚期胃癌患者，属于胃癌治疗的三线药物，对晚期胃癌患者生存期的延长有着良好的效果。然而，目前尚未17有临床研究涉及阿帕替尼在早期及中期胃癌方面的治疗，如果在胃癌的早期使用阿帕替尼，是否能通过对肿瘤血管生成的抑制有效遏制胃癌的进展；阿帕替尼与紫杉醇联用是否对胃癌细胞有更好的杀灭作用，这些都尚不得而知。本课题旨在从细胞、蛋白水平研究阿帕替尼单药与胃

5、癌化疗药物紫杉醇联用后的相互作用及其可能机制，为临床治疗提供一定的启示。一、材料与方法（一）实验材料1.实验室浙江中医药大学附属第一医院中心实验室2.细胞株人低分化胃腺癌细胞株MGC-803（购于中国科学院上海细胞库）3.实验药品及试剂阿帕替尼（Apatinib）：江苏恒瑞公司PRMI-1640培养基：美国GIBCO公司胎牛血清（FBS）：美国GIBCO公司PBS：美国Thermo公司二甲基亚砜（DMSO）：美国Thermo公司N,N-二甲基甲酰胺（DMF）：美国Sigma公司胰蛋白酶-EDTA消化液：Solarbio公司CCK-8试剂盒：康为世纪AnnexinVFITC/IP凋亡检查

6、试剂盒：康为世纪周期检测试剂盒：康为世纪抗β-actin单克隆抗体：美国Proteintech公司抗PKC,p-PKC(α/βⅡThr683/641)：美国CST公司p44/42MAPK(ERK1/2)：美国CST公司p-p44/42MAPK(p-ERK1/2)(Thr202/Tyr204)：美国CST公司17红色上样缓冲液：美国CST公司紫杉醇（Paclitaxel）：美国Sigma公司4.主要仪器设备FormaClassⅡA2生物安全柜（Thermo，美国）；Forma3111细胞培养箱（Thermo，美国）；VarioskanFlash多功能酶标仪（Thermo，美国）；SORV

7、ALLST16R离心机（Thermo，美国）；-80℃超低温冰箱（Thermo，美国）；4℃冰箱（海尔，中国），FACSCantoⅡ流式细胞仪（BD，美国）；Power-pac基础电泳仪Bio-Rad，美国）；ChemiDocMP全能型凝胶成像分析系统（Bio-Rad，美国）；10-100ul、100-1000ul可调移液器（Eppendorf,德国）；20-200ul八道可调移液器（HighTechLab,波兰）。（二）实验方法（1）细胞培养