球虫试验计划

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1、摘要：对南昌市场购买的成年鸡肠道，采用饱和盐水漂浮法检查，同时从肠内容物中获取混合球虫卵囊。在制备好的琼脂薄层的载玻片上滴加稀释适度的混合卵囊液。在显微镜下用手术刀片小心切割琼脂薄层，达到琼脂薄层上仅剩单一卵囊的严格要求。把单一卵囊包裹后经口感染雏鸡，又从感染雏鸡粪便中收集大量球虫卵囊待孢子化后再次重度感染雏鸡，掌握该球虫虫株特征及感染鸡的病理变化。结果表明：单卵囊感染雏鸡，感染率为40%；经增殖传代球虫卵囊感染雏鸡虫株，初步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫(Eimeriaacevulina)。关键词：堆型艾美耳球虫；南昌株；分离；

2、鉴定v1材料与方法1.1材料1.1.1混合球虫卵囊。从南昌市场购买成年鸡肠道内容物获取。1.1.2试验动物。1日龄雄性雏鸡20只（购自南昌青云谱区，熊坊乡某孵化场）1.1.3试验药品。重铬酸钾（AR级），食用盐（江西盐业集团公司），琼脂条。1.1.4试验器械。生化培养箱，离心机，普通天平，内光源生物显微镜，1000W双联电炉，数码照相机，物测微尺和目测微尺，钢铝锅，500mL搪瓷杯，60mL三角瓶，60目铜筛，260目尼纶筛，眼科镊，胶头吸管，250mL烧杯。1.2方法1.2.1饱和食盐水与2.5%重铬酸钾液的制备。以量筒

3、量取清水1000mL至钢铝锅内，电炉加热沸腾，倒入食盐380g搅拌、溶解、冷却、过滤即为饱和盐水；以重铬酸钾25g溶于1000mL清水中即为2.5%重铬酸钾液。1.2.2混合球虫卵囊检查、收集培养。取肠内容物于搪瓷缸内，加少量饱和盐水捣碎搅拌成糊状，再加65mL饱和盐水搅匀，经60目铜筛和260目尼纶筛过滤，滤液盛满60mL的三角瓶内并成凸形，静置20min后载玻片触及凸点迅速翻转，在16×16倍显微镜下观察寻找卵囊，发现大量卵囊后用胶头吸管吸取上浮液于青霉素空瓶内，兑加2.5%重铬酸钾液3mL，置30℃生化培养箱内培养2

4、4h备用。1.2.3雏鸡的饲养与管理。雄性雏鸡饲养于杀灭卵囊的纸盒内或大鼠笼内，饲喂新鲜小鸡料和洁净清水，每次做到先洗手后饲喂雏鸡，杜绝意外球虫卵囊感染。1.2.4单卵囊分离。用天平秤取琼脂条1g于250mL烧杯中，添加清水100mL，电炉加热沸腾搅拌成透明状，趁热用胶头吸管滴加胶冻液于载玻片上，待冷却后再用胶头吸管取已孢子化的混合球虫卵囊于成型的琼脂薄层上，置显微镜下逐行寻找球虫卵囊，卵囊密度控制在每个视野约有5~7个，显微镜观察下用手术刀片细心切割琼脂薄层，使琼脂薄层上仅留一个球虫卵囊，确认一个卵囊后将该小块琼脂转移置

5、较大琼脂薄层上并包裹好。1.2.5单卵囊感染。在助手协同下打开雏鸡喙，将包裹物经口腔滴加少量清水确认喂服。共感染10只7日龄雏鸡，记录感染时间，分笼饲养。1.2.6纯种子代卵囊收集与感染。第4~8d开始每天用饱和盐水漂浮法检查雏鸡新鲜粪便，当检查有球虫卵囊时记录鸡只和排出卵囊时间并开始收集卵囊。取新鲜雏鸡粪便于500mL搪瓷杯内，杯内装有，杯内装有一定量的5℃清水。待收集一定量粪便后，将搪瓷杯内原有的清水倾去并捣碎成糊状，加350mL清水混匀，经60目铜筛及260目尼纶筛过滤，滤液分装8支离心管，每支45mL，以2000r

6、/min离心5min；留沉淀物，取少许沉淀物与10mL饱和食盐水搅拌。搅拌后8支管归装于1支管。倒完沉淀物的7支离心管分别加10mL清水，以2000r/min离心5min，留含沉淀物离心管内的上液弃沉渣，再兑加清水至45mL处，以2000r/min离心10min，弃上清液留沉淀溶液少许，这样加清水重复离心洗净，最后将富含卵囊沉淀液从离心管中用吸管吸出移入60mL三角瓶内[7]，加等量5%重铬酸钾液置30℃生化培养箱内培养。1.2.7纯种孢子化卵囊感染。胶头吸管吸取含大量卵囊液，经口感染12日龄雏鸡10只，7d后每天剖检2只

7、雏鸡，观察肠道表面病变情况并照相。1.2.8虫株的鉴定。取少量已孢子化的球虫卵囊液于载玻片上，在16×40倍显微镜下观察发现该球虫卵囊有几种形态，有无极粒、卵囊及孢子囊残体、斯氏体等。用显微测微尺测量卵囊大小及孢子囊大小，测量100个该卵囊，算出其卵囊大小的平均值及卵囊形状指数，结合潜隐期及肠道表面病变部位,比对感染雏鸡病理变化堆型艾美耳球虫多在上表皮层发育，并且同一发育阶段的虫体聚集在一起；被损害的十二脂肠和小肠前段出现大量白色小斑点，引起肠道肿胀、出血。（2.4雏鸡感染球虫卵囊虫株的鉴定采用1只感染成功的雏鸡排出的卵囊

8、，经增殖传代的球虫卵囊感染雏鸡虫株，根据其特征，初步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫(Eimeriaacevulina)。（见下表）表1鸡堆型艾美耳球虫(Eimeriaacevulina)虫株的鉴定鸡堆型艾美耳球虫卵囊特征3分析与讨论3.1虫株分离技术的意义雏鸡感染球虫在自然情况下多是混合感染,而以某一种占优势。