荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析

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1、生物工程学报ChinJBiotech2011,September25;27(9):1317−1325journals.im.ac.cnChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@im.ac.cn©2011CJB,Allrightsreserved.工业生物技术荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆、表达及酶学性质分析薛群，应向贤，杨池，汪钊浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州310014摘要:为了研究荧光假单胞菌中短链脱氢酶的生理角色和催化特性，从荧光假单胞菌PseudomonasfluorescensGIM1.49基因组DN

2、A克隆表达了一个短链脱氢酶的编码基因pfd，并分析了该基因产物的酶学性质。基因pfd全长684bp，编码227个氨基酸，推算分子量为24.2kDa。将携带短链脱氢酶基因的重组质粒pET28b-pfd转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，得到了28kDa的表达产物。重组荧光假单胞菌短链脱氢酶(PFD)能氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯、1-苯乙醇、苯甲醇、仲丁醇和还原4-氯-乙酰乙酸乙酯、2-溴-苯乙酮、4-溴-苯乙酮等底物。以4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物时活力最高，Km值为186.90mmol/L，Vmax为89.56U/mg。氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯时，最适

3、反应温度和pH+分别为12℃和10.5，倾向于利用NAD作辅酶；而还原4-氯-乙酰乙酸乙酯时，最适温度和pH为24℃和8.8，倾向于2+利用NADPH作辅酶。重组PFD能耐受50％(V/V)的甲醇等有机助溶剂，Ca(1mmol/L)和EDTA(5mmol/L)对其酶活有一定的促进作用。上述结果表明，重组PFD是一个新型的短链脱氢酶，其代谢角色推测与卤代次级醇的氧化降解有关。关键词:短链脱氢酶，荧光假单胞菌，克隆与表达，酶学性质Cloning,expressionandcharacterizationofashort-chaindehydrogenasefromPs

4、eudomonasfluorescensQunXue,XiangxianYing,ChiYang,andZhaoWangCollegeofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310014,ChinaAbstract:Toexplorethephysiologicalroleandbiocatalyticpropertiesofshort-chaindehydrogenasesfromPseudomonasfluorescensGIM1.49,wec

5、lonedthestructuralgenepfdandcharacterizeditsover-expressedproduct.Thelengthofgenepfdwas684bpencodingashort-chaindehydrogenasewith227aminoacidresiduesandcalculatedmolecularmassof24.2kDa.TherecombinantplasmidpET28b-pfdwasconstructedandfunctionallyexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3),resu

6、ltingintheover-productionofrecombinantshort-chaindehydrogenasePFDwithasizeof28kDa.Theenzymecouldoxidizealcoholsincluding4-chloro-3-hydroxbutanoateesterandreduce4-chloro-acetoacetateesterusingeitherNAD(H)orNADP(H)ascoenzyme.Theenzymeshowedthehighestactivityagainst4-chloro-3-hydroxbutan

7、oateesterassubstrate,withKmofReceived:January19,2011;Accepted:April20,2011Supportedby:QianjiangTalentProgramofZhejiangProvince(No.2009R10048),ScientificResearchFoundationofZhejiangUniversityofTechnology(No.20090172).Correspondingauthor:ZhaoWang.Tel/Fax:+86-571-88320781;E-mail:hzwangzh

8、ao@16