第9章 生化分离技术及应用

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1、第九章生化分离技术及应用本章重点主要纯化方法（分配层析，吸附层析，凝胶过滤层析，离子交换层析，亲和层析，疏水层析，不连续PAGE，SDS-PAGE，等电点聚焦，双向电泳）的原理？蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？蛋白质分离纯化一般原则大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离一离心机(分析性超速离心主要用于检测大分子物质的沉㈠种类离心机降特征和结构等)制备型分析型分析性超速离心机普通离心机冰冻离心机台式（或地台式高、超速大容量冰高速冰冻超速冰冻面式）普通离心机冻离心机离心机离心机

2、离心机0.6-10万转/分小于0.6万0.6-2.5万2.5-8万或转/分更高⒈普通制备型离心机分离、浓缩、提纯样品中，固液分离。⑴台式或地面式普通离心机低、中速离心机，转速在3000—6000rpm，这类离心机可用于收集易沉降的大颗粒（如红血球、酵母细胞以及组织块等）。⑵台式高、超速离心机转速0.6-10万转/分或更高。这类离心机可用于收集不易沉降的细胞器、膜等小颗粒。⒉制备型冰冻离心机因此需要有冷却离心腔的致冷设备，一般温度控制在0—4℃，速度控制准确；可用于收集微生物、细胞碎片、大细胞器、免疫沉降

3、物等，病毒、小细胞器（如核糖体）、蛋白质等大分子。⑴大容量冰冻离心机，小于0.6万转/分⑵高速冰冻离心机，0.6-2.5万⑶超速冰冻离心机，2.5-8万或更高⒊分析型超速离心机XL-A分析型超速离心机主要技术指标：检测波长范围200nm-800nm转子最大转速40000RPM(二)相关概念⑴沉降系数（s）：指单位离心力作用下颗粒沉降的速度。蛋白质，核酸，核糖体，病毒等的沉降系数介于1-200×10-13的范围。为方便起见，把10-13秒作为一个单位，用S表示，1S单位等于1×10-13秒。⑵沉降速度：是指在

4、强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。颗粒沉降的时间和速度取决于：离心力、颗粒的大小形状和密度、沉降介质的密度和黏度。㈢离心技术类型已破碎的细胞差速离心法和密度梯度500g,10’离心法（速率区带离心、等密度离心）⒈差速离心法沉淀上清液原理：采用逐渐增加(细胞核)10000g,10’离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒沉淀(细胞膜在不同的分离速度及上清液碎片、线粒体、溶酶体)不同的离心时间下分100000g,3h批分离的方法，称为差速离心法。常用于从组织匀浆中沉淀上清液分离细

5、胞和病毒。(核糖核蛋白体)(可溶性组分)⒉速率—区带离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法介质梯度应预先形成可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分⒊等密度梯度离心原理：不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度

6、，让颗粒在梯度中进行再分配。此法常用CsCl、等做介质,一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。二、层析㈠、概述•层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。•后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。•1944年出现纸层析，以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层

7、析、凝胶层析等。⒈层析法的基本原理层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数、极性、带电量等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。⒉层析法的分类⑴按层析过程的机理分类•吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。•疏水层析：利用不同组分与基质疏水相互作用不同，使之分离。•离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂结合力的不同。•凝胶层析

8、：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分排阻作用的不同。•亲和层析：利用物质间的特异性亲和力分离特定物质。⑵按两相所处的状态分类流动相有两种状态：*液体作为流动相*气体作为流动相固定相也有两种状态：*固体吸附剂作为固定相*以吸附在固体上的液体作为固定相液-固层析液相层析液-液层析气-固层析气相层析气-液层析⑶按操作形式不同分类柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后