反复胰蛋白酶消化法培养SD大鼠视网膜Muller细胞

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1、万方数据沈阳医学院学报JournalofShenyangMedicalCollege第11卷第3期2009年9月反复胰蛋白酶消化法培养SD大鼠视网膜Muller细胞王若冰(上海第二军医大学附属一院眼科，上海200433)[摘要]目的：通过反复胰蛋白酶消化法，建立Muller细胞的培养和纯化方法。方法：采用新生7天的SD大鼠，解剖镜下取视网膜，反复胰蛋白酶消化法消化贴壁后的细胞，细胞形态一致后行免疫组织化学和形态学检查。结果：所得细胞的90％左右谷氨酰胺合成酶(GS)免疫组化染色阳性；荧光显微镜下可见细胞胞体巨大，足突明显，证明是Muller细胞。结论：反复胰蛋

2、白酶消化法是一种简单、可靠的Muller细胞培养方法。[关键词]Muller细胞；细胞培养；胰蛋白酶消化法[中图分类号]R774[文献标识码]A[文章编号]1008—2344(2009)03—0171—03RepeatedPancreaticEnzyme-degistingMethodforCulturingMullerCellsofSDRatsWANGRuo-bing(DepartmentofOphthalmology，TheFirstAtfiliatedHospitalofTheSecondMilitaryMedicalSchool，Shanghai200

3、433，China)[Abstract】Objective：Tofindawaytocultureandpu曲Mullercellsbyseriesofsteps．Method：Retinasof7-day—newbornrats，eyeballswererequiredunderanatomicalmicroscope，repeatedpancreaticenzymedigestingaftercellswereattachedtonutritivefflediUl／1．Mullercellswereidentifiedbyi删bemitry．andthem

4、orphologyobservedbyafluorescencemicroscope．Results：CeⅡsculturedhavelargecellbodiesandinorethanorefootprocesses．About90％ceilsarepositivestainingforglutaIllinesynthetase．provedtobeMullercell．Conclusion：RepeatedpancreaticenzylYle—digestingmethodisasidleandreliablewayforculturingMullerc

5、ells．[Keywords]Mullercell；cellculture；enzyme-degistingmethod人们对Muller细胞的关注始于神经生物学家发现视网膜电图的b波源于Muller细胞的去极化。实际上，Muller细胞作为视网膜最主要的神经胶质细胞贯穿整个视网膜，包绕视网膜上各级神经元的胞体、突起及视网膜血管，毗邻视网膜周围结构；在功能上起着大脑三种胶质细胞的典型作用⋯。随着分子生物学技术的发展和膜片钳等新技术的应用，已经有越来越多的研究表明，Muller细胞上分布着种类丰富、数量各异的离子通道、神经递质受体及载体，特异性地表达多种酶；具有

6、维系细胞外微环境的稳定、供给神经元代谢的能量、缓冲细胞内外离子浓度和水容量变化等多种功能。因此建立体外稳定的Muller细胞培养体系对于今后研究Muller细胞乃至视网膜的病生理意义重大。我们通过实验证明，反复胰蛋白酶消化法能够比较简单的获得较纯、稳定的Muller细胞，现报告如下。1材料与方法1．1取材取出生后7天未睁眼的SD大鼠5只，75％酒精消毒同时将其浸溺，无菌条件下取出眼球。D—Hanks液(美国Hyelone公司)冲洗数遍，再置于解剖显微镜下去除眼前节组织，虹膜恢复器小心剥离视网膜神经上皮，再置于含5mlD．Hanks液的培养皿中。显微眼科剪将其尽

7、可能剪成小于1mm的碎块，加入5ml0．25％胰蛋白酶(杭州四季青公司)，37℃消化30rain，铜网(200目)过滤后，将过滤液移入离心管中，l200r／min，持续5min。弃上清液加入含15％胎牛血清(美国Hyclone公司)的DMEM培养基(含青霉素100pLmoUml，链霉素100斗moL／m1)(美国Hyelone公司)，吸管吹打后，细胞悬浮5rain，接种于培养瓶中。5天后换液，换液3天后融合，加入0．1％胰蛋白酶(杭州四季青公司)，荧光显微镜下观察(LEICA公司)，待细胞收缩，部分细胞悬浮后，将其吸出弃掉，加入含15％胎牛血清的DMEM培养基

8、继续培养。如此反复消化3遍，细胞形态基