辛伐他汀对不同缺氧条件下大鼠BMECS通透性影响的实验研究

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1、第三军医大学硕士学位论文辛伐他汀对不同缺氧条件下大鼠BMECs通透性影响的实验研究姓名：鲁向辉申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：迟路湘20080501第三军医大学硕士学位论文辛伐他汀对不同缺氧条件下大鼠BMECs通透性影响的实验研究摘要背景和目的：缺血缺氧性脑损伤是临床上最常见的脑血管疾病，血管再通后由于再灌注的作用，损伤表现更著，研究其可能的改善及治疗办法具有非常重要的价值。他汀类药物为3．羟基．3．甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy一3-methylglutarylcoenzymeAreductasei1111ibi-tors，HMG．CoA)还原酶抑制剂

2、，是一种临床上广泛使用的降血脂药物。近年来基于其一系列非调脂性脑缺血保护效应，而被广泛应用于缺血性脑血管病。一研究发现它具有重要的逆向作用，可减轻产生于脑缺血和再灌注期脑血管和脑实质内的许多病理生理过程。动物实验已证实：他汀类药物可明显减小缺血脑损伤大鼠脑梗死面积，显著减轻其脑水肿程度、改善预后转归。血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)是维持脑内微环境的重要结构，作为其结构基础的脑微血管内皮细胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMECs)与外周血管内皮细胞不同，在基因、蛋白质组水平及生理结构上均有其特异性。该结构的损

3、伤必将导致脑内微环境的变化，从而引起脑神经细胞功能、代谢与结构的改变。而BBB损伤中，通透性变化是最基本的，也是最直接的损伤体现。因此，探讨他汀对不同缺氧状态下BMECs通透性的影响，能针对性地从细胞水平研究上述动物实验结果的可能机制。本课题拟构建BMECs短暂缺氧(transienthypoxia，TH)、持续低氧(conti肌oushypoxia，CH)、复氧(reoxygenation，R)模型，观察不同缺氧条件下及他汀类干预后BMECs单层通透性的变化，及基质金属蛋白酶一9(matrixmetallopro．teinase，MMP一9)、诱导型一氧化氮合酶(indu

4、cednitricoxidesynthase，iNOS)、缺氧诱导因子一10【(hypoxiainduciblefactor_lQ，HIF．1a)的表达情况，并探讨他汀类对不同缺氧条件下BMECs单层通透性影响可能相关机制，为解释其减轻不同氧条件下脑损伤的作用提供实验依据。研究方法：采用2次酶消化加20％BSA离心法分离培养SD大鼠BMECs，用不同缺氧缺糖条件建立BMECsTH、CH、R模型。其中TH组为低糖DMEM培养基环境，置于37℃的6第三军医大学硕十学位论文3％02、5％C02、92％N2低氧培养箱中培养0．5h；CH组为无糖心ebs溶液环境，低氧培养箱中培养12

5、h；R组同CH组处理12h后，更换低糖DMEM培养基置于37℃，5％C02常氧培养箱中复氧4h。采用BSA通透实验、跨内皮电阻(transendothelialelectricalresistance，TEER)测量并结合CCK-8细胞增殖活性测定以了解不同缺氧条件下BMECs通透性的变化及辛伐他汀(0．1、1．0、10¨mol／L)、iNOS抑制剂：硫酸甲基异硫脲(SMT)、MMP一9抑制剂I(MI)、HIF．10【抑制剂：三羟基异黄酮(GEN)干预后的影响；采用iNOS试剂盒测定各组iNOS活性；免疫细胞荧光化学法测定MMP．9、HIF—lO【表达，激光共聚焦显微镜摄影

6、后进行计算机图像分析。研究结果：实验一：1．BMECs形态观察及鉴定：BMECs呈紧密连接的铺路石样单层生长；免疫荧光细胞化学法检测vwF蛋白呈阳性表达，阳性率可达95％；生长高峰在3～6d。原代BMECs具有很强的屏障特性。与其相比，第4代后TEER值有显著性下降(P

7、0．05)。经MI、SMT、GEN干预后，CH、R组TEER、细胞增殖活性均有显著改善(P