杂交瘤技术与单克隆抗体

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1、第12章杂交瘤技术与单克隆抗体新民周刊2010,5.17-23.P76-92010.11.2：世界肺炎日（第2个）全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病，平均每38秒1名5岁下儿童死于此病，1100万儿童因肺炎住院。中国是10个肺炎发病率最高的国家之一，1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占46.8%。占西太平洋区的70%。红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达86%。1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世。目前已经接种3亿剂，世界第一大单个疫苗。2003年SARS病毒SARS病毒属于冠

2、状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在80-120nm之间。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解，病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外，多聚集成堆。HIV病毒-艾滋病HIV是艾滋病病毒（humanimmunodeficiencyvirus）的缩写。“人类免疫缺陷病毒”。逆转录病毒，遗传信息存在于两个相同的RNA单链模板中。艾滋病是1981年发现的。生存于人的血液中并攻击人体免疫系统。把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫系统遭到破坏，最终人体丧失对各种

3、疾病的抵抗能力而导致死亡。12-1杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridomatechnique）。历史发现1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。科勒（Kohler）米尔斯坦（Milstein）（一）免疫学基础1抗原：进入

4、动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：结构表位性（抗原决定簇）12-2单克隆抗体免疫原特异性：（抗原与抗体的反应）抗原---刺激免疫系统---发生免疫应答-----产生应答产物。抗原的表位◆抗原决定簇:(antigendeterminant）；又称为表位（epitope）。存在于抗原分子表面的，能与淋巴细胞表面特定受体或其分泌的抗体相结合的特殊化学基团，称为抗原决定簇或表位。18T细胞与B细胞抗原决定簇的比较2抗体互补性决定区（Complementaritydeterminingregion，CDR）

5、VH和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体的多样性与特异性。动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。•C：constantregion•V：variableregion抗体的来源免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细胞包括B淋巴细胞——发育成浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌。T淋巴细胞——发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B淋巴细胞产生抗体。（二）多克隆抗体与单克隆抗体概念单克隆抗体(mo

6、noclonalantibody,McAb)：经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体，把这种具有特异性的、同质性的抗体称为单克隆抗体。P126动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体，一个B细胞就是一个克隆，故称为单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。问题的引出血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。3单克隆抗体生产途径：

7、细胞融合：杂交瘤细胞病毒转化：获得永久生长的B淋巴细胞视频：http://v.youku.com/v_show/id_XMTY1ODg5MDI0.html(三）杂交瘤制备单克隆抗体单克隆抗体技术分非特异性、特异性两类1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备体外法：用抗原免疫离体的淋巴细胞，3-4d收获。体内法：一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）3个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，用无血清的培养液制备成B细胞悬液。2.骨髓瘤细胞株的培养与筛选骨髓瘤细胞系应和免疫B淋巴细胞源于同一品系动