淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术

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1、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。　　制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。　　一、细胞融合前准备　　(一)　免疫方案　　

2、选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。　　1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5mlip(腹腔内注射)　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5mlip　　　　　　　　　　　　↓　3周后　　　　　　　　　　加强免疫(融合前三天)　1×10７／0.5mli

3、p或iv(静脉内注射)　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　　取脾融合　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。　　　　　　初次免疫　Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／点)　　　　　　　　↓3周后　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂

4、皮下或ip　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml)　　　　　　　　↓3周后　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip　　　　　　　　│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)　　　　　　　　↓2～3周后　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv　　　　　　　　↓3天后　　　　　　　取脾融合　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射

5、。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。　　(二)　饲养细胞　　在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。　　　　　小鼠腹腔巨噬细胞的制备　　　　　小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄　　　　　　↓　　　　　拉颈处

6、死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟　　　　　　↓　　　　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜　　　　　　↓　　　　　用无菌注射器注入6～8ml培养液　　　　　　↓　　　　　反复冲洗，吸出冲洗液　　　　　　↓　　　　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟　　　　　　↓　　　　　用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml　　　　　　↓　　　　　加入96孔板，100μl／孔　　　　　　↓　　　　　放入37℃　CO2孵箱培养　　一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬

7、细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。　　(三)　骨髓瘤细胞　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量　McAb。　　常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63Ag8.653等。　　骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传

8、代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。　　一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的