IL27对急性单核细胞白血病细胞株U937作用的初步研究

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1、中山大学硕士学位论文IL-27对急性单核细胞白血病细胞株U937作用的初步研究IL．27对急性单核细胞白血病细胞株U937作用的初步研究专业名称：内科学学位申请人刘彬彬导师：林东军教授中文摘要急性白血病是在骨髓和其他造血组织中原始和幼稚细胞异常增生的恶性疾病，平均自然病程半年，在30岁以下人群的肿瘤发病率中占据首要地位。其中急性单核细胞白血病的高白细胞性白血病发生率高，髓外浸润严重，治疗难度大，预后较差。虽然联合化疗和造血干细胞移植的开展，大大提高了缓解率，但仍存在缓解后复发、移植供者少等问题。近年

2、来生物制剂逐渐引起人们的重视并已应用于肿瘤的临床治疗。白细胞介素．27(interleukine27，IL．27)是2002年发现并命名的一种新的细胞因子，它与IL．12以及另一种新发现的细胞因子IL．23共同组成IL．12分子家族，具有复杂的生物学功能，在抗感染免疫，抗肿瘤免疫以及自身免疫病中发挥着重要的作用。IL．27主要通过肿瘤特异性CDS+T细胞、分泌IL．12发挥抗肿瘤作用，而对免疫原性低的肿瘤，则可以通过抑制血管形成来抑制肿瘤的生长和转移。此外，IL．27尚能不依赖免疫细胞而发挥抗瘤效应

3、。IL．27的抗肿瘤作用研究目前多局限于黑色素瘤，结肠癌，神经胶质瘤、神经母细胞瘤、食管癌、原发性肝癌等实体瘤，与造血系统恶性肿瘤的关系尚不明确，在诱导靶细胞凋亡方面的研究也鲜见报道。为了探讨IL．27在白血病中的性质和作用，我们完成了以下研究工作：检测了31例AML病人和8例非恶性血液病患者BM．MNCs的IL．27受体(WSX．1和gpl30)mRNA基因表达情况，探讨IL．27在急性髓细胞白血病发病中的意义。我们的研究发现，IL．27受体WSX．1和gpl30在AML患者中表达明显高于非恶中山

4、大学硕士学位论文JL-27对急性单核细胞自血病细胞株U937作用的初步研究性血液病患者(包括IDA、ITP和非血液病患者)，尤其在AML．M5(急性单核细胞白血病)病人高表达，在此基础上，我们利用人急性单核细胞白血病细胞株U937为研究对象，探讨rhIL．27诱导U937细胞分泌抗肿瘤性细胞因子，抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡作用，发现rhIL．27能够诱导U937细胞产生抗肿瘤性细胞因子TNF．Cl和IL．12，抑制U937细胞生长并诱导细胞凋亡，且细胞增殖抑制率、细胞凋亡率与TNF．a分泌量呈正

5、线性相关。我们的工作首次证明，与实体瘤相似，IL．27亦可抑制造血系统恶性肿瘤，具体作用机制值得进一步探讨。研究目的一、检测人白介素27的两个受体(wsx．1和gpl30)在急性髓细胞白血病病人与非恶性血液病病人的骨髓单个核细胞(BM．MNCs)上的表达差异；二、研究IL．27诱导人单核白血病细胞U937分泌抗肿瘤细胞因子TNF．Q和IL．12，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。材料和方法一、实验材料(一)主要仪器设备C02培养箱，超净工作台，PCR仪，酶标仪，核酸蛋白分析仪，台式超速离心机，恒压电

6、泳仪，凝胶成像分析系统，荧光正置显微镜，流式细胞仪。(二)试剂及细胞株U937细胞株；6孔、24孔、96孔细胞培养板，细胞培养瓶；小牛血清，RPMll640培养基；淋巴细胞分离液、琼脂糖，TRIzol；100bpDNAladdermarker、cDNA第一链合成试剂盒、2×TaqPCRMasterMi试剂盒；阿糖胞苷(Ara-C)；四氮甲唑蓝(MTr)、DMSO；人IL．12ELISA试剂盒、人TNF．QELISA试剂盒。FITCAnnexinVApoptosisDetectionKit，人重组IL

7、．27，Hoechst染色试剂盒。二、实验方法收集我科3l例初治及复发成人AML患者骨髓血，同时采集8例非恶性血液病患者骨髓(包括IDA、ITP，非血液病患者)为对照，所有白血病患者骨髓幼稚细胞比例均>60％，经过临床、骨髓细胞形态学、组织化学染色以及流式细胞术进行细胞表面标志物检查，按照2001年WHO诊断标准确诊。31例患者包括急性粒细胞白血病未分化型(M1)l例，急性粒细胞白血病部分分化型(M2)10例，中山大学硕士学位论文11．-27对急性单核细胞白血病细胞株U937作用的初步研究急性早幼粒

8、细胞白血病(M3)7例，急性粒单核细胞白血病(M4)3例，急性单核细胞白血病(M5)10例。从人骨髓血单个核细胞中提取总RNA，经逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测目的基因WSX·l和gpl30的表达条带。此基础上，在体外以人急性单核细胞白血病细胞株U937为研究对象，以不同浓度rhlL．27刺激细胞，采用ELISA法测定培养上清中IL．12和TNF．Q水平，MTT比色法测定细胞生长抑制率，Hoechst染色鉴定凋亡细胞的形态学特征，ArmexinV／PI双染流