生物技术之植物转基因

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1、第六节植物遗传转化体系一、植物遗传转化载体系统二、植物遗传转化方法及原理三、转化子的鉴定与遗传分析一、植物转化载体系统质粒载体系统病毒载体系统无筛选标记载体系统植物转基因载体--启动子诱导型启动子地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR系统乙醇诱导系统等克隆表达载体无选择标记转化系统重组：Cre/Lop、R/RS系统借助于转座子：Ac/Ds共转化选择标记基因的组织特异性表达用两个独立的质粒,其中一个含有选择标记基因,另一个含有目的基因,同时转化目的细胞,两个质粒可同时整合进植物细胞内。但两个基因多整合在不同位点,经转化植株后代的

2、遗传重组,目的基因便可与选择标记基因分开,得到无选择标记基因的转化植株返回二、植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。直接基因转移技术包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该

3、菌细胞内的野生型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。1、农杆菌介导的植物遗传转化体系AgrobacteriumMediatedTransformation农杆菌致病－冠瘿瘤农杆菌生物学特性农杆菌介导的转化是目前唯一被人类所认识的生物界之间自发交换遗传物质的天然转化体系。农杆菌将其Ti质粒上的T－DNA和一些毒性蛋白（Virproteins）转入寄主植物细胞，在Vir蛋白和寄主植物蛋白辅助下，T－DNA整合在寄主植物染色体上，并最终在寄主植物中表达T－DNA上的基因。Ti质粒特性Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的双链环状DNA分子，含200～80

4、0Kb，具有五个主要功能区域：①.T-DNA：（transferredDNA）LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组；②.质粒转移区(PT)；③.冠瘿碱(opine)代谢区；④.复制原点（originalreplicationregion，Ori）；⑤.毒性区（virulenceregion，Vir）其中Vir区和T-DNA区与冠瘿瘤的生成有关，结合转移区是细菌吸收和利用冠瘿碱的区域。Ti质粒的图谱tms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱大小：160-240kb其中T-DNA

5、12-24kbT-DNAT-DNA可以将其间携带的基因整合到植物基因组中，但这些基因本身与T-DNA的转移和整合无关，仅仅T-DNA左右两端边界各有一个25bp的正反重复序列是其加工所必须的。左右两边界之间对序列可以被其它序列替换，如目的基因。Vir区Vir区大小：约30kb大小；Vir区：包括A－J等10个操纵子（operator），由24个基因起共调控（co-regulation）作用，Vir蛋白对作用：Vir区基因需要在植物细胞释放的信号因子激活下才能表达，其编码蛋白决定了T-DNA的加工和转移。部分Vir蛋白在农杆菌中和在植物中的功能vir蛋白

6、Virulenceprotein在农杆菌中的功能FunctioninAgrobacterium在植物细胞中的功能Functionintheplant文献VirA双组分信号传导体系的酚类物质传感体－VirG对酚类物质信号反应的调节子－VirB1-11合成和组装成T菌毛（VirB2编码产物是前提物质）－VirC1促进VirD2的酶解作用可能为结合蛋白，促进T－DNA转运－VirD1T-DNA加工和双链T－DNA边界缺刻所需要的VirD2T-DNA边界特异性内切酶T-DNA转移引导蛋白，使T－DNA进入植物细胞T-链的核定位保护T-链5’端免遭外切酶降解参与

7、T-DNA的整合VirE1参与VirE2从农杆菌中转移进入植物细胞，是VirE2的分子伴侣－VirE2在农杆菌中形成T-链复合体(?)形成极性T-DNA复合体(?)保护T-DNA链免遭内切酶降解T-链核定位T－链进入核孔的通道VirF决定寄主范围，可转移进入植物细胞核与SKP1蛋白互作水解VIP1和VirE2VirH(PinF)细胞色素P450酶－VirJ/AcvBT-链结合蛋白，帮助T-链输出细菌－Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物

8、将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复