转基因动植物

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1、第三节转基因动植物一、转基因动物（一）转基因动物简介转基因动物指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物(如鼠、兔、羊和猪)的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40DNA转基因小鼠。1980年，Gordon等人首先育成带有人胸苷激酶基因的转基因小鼠。尤其是1982年Palmiter等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受

2、精卵的雄原核中，获得比普通小鼠生长速度快2~4倍，体形大一倍的转基因“硕鼠”后，转基因动物技术轰动了整个生命科学界。随后的十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域，并取得了许多有价值的研究成果。（二）转基因动物培育的原理与方法转基因动物培育的基本原理是借助分子生物学和胚胎工程的技术，将外源目的基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携

3、带有外源基因的转基因动物。培育转基因动物的关键技术包括：外源目的基因的制备，外源目的基因的有效导入，胚胎培养与移植，外源目的基因表达的检测等。根据目的基因导入的方法与对象不同，培育转基因动物的主要方法有基因显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法等（图1-2）。图1-2培育转基因动物的三种方法示意图1、基因显微注射法以培育转基因小鼠为例，其培育程序如图1-3。包括以下基本步骤：图1-3 基因显微注射法培育转基因小鼠示意图（1）目的基因的制备与纯化：目的基因可以来源于：①通过限制性内切酶预先分离的某一基因

4、。②逆转录法得到的cDNA。③人工合成的DNA片段。④聚合酶链式反应（PCR）扩增的特定基因片段。目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组因子，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒，再分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。目的基因的克隆也可以通过ＰＣＲ来实现。（2）卵供体母鼠和假孕母鼠的准备：定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎公鼠。这些鼠的有关要求如表1-1。（3）超排卵与取卵：选择4~6周龄母鼠，注射孕马血清促性腺

5、激素（PMSG）后，隔42~48h再注射人绒毛膜促性腺激素（HCG），注射HCG后10~13h剖腹取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。（4）基因显微注射：用专门的持卵管和注射针，在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因（DNA）注射到受精卵的雄性原核内（雄性原核较雌性原核大）。（5）受精卵移植：转基因受精卵在单细胞至桑椹胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植20~30个转基因卵为宜。（6）目的基因的表达整合鉴定和检测：从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用

6、PCR、Southernbolt(DNA印迹)、FLSH(荧光原位杂交)等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定，并通过Northernblot(RNA印迹)和Westernblot（蛋白质印迹）等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。经检测获得阳性Founder小鼠（首建鼠）。（7）建系：将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50%左右时，即基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经扩大繁殖，从中选择外源目的基因表达效果好、适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。然后从子代

7、中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立遗传基因小鼠近交系。2、逆转录病毒感染法逆转录病毒具有有效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。因此，利用逆转录病毒作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物(chimericanimal)，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。下面介绍其中几项关键步骤。（1）逆转录病毒载体的构建：常以禽类和鼠类的逆转录病毒为载体。其构建步骤包括：①提取病毒未整合的环状DNA。②将环状DNA克隆到适当的载体中。③选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除，如构建可复制型载体，则

8、切除其他部分非结构蛋白基因，如致癌基因等。④将外源目的基因克隆到载体中。⑤转染细胞，测定外源基因的表达。（2）包装细胞：又称辅助细胞，它能为逆转录病毒载体提供包装蛋白，对逆转录病毒载体功能的发挥起着重要的作用，决定着重组病毒效价及其宿主范围。在哺乳动物，最常用的包装细胞是φ-2细胞株，在其