基因传感器检测木质素降解酶基因及堆肥群落多样性研究

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1、硕卜学f讧论文摘要堆肥化技术在城市生活垃圾处理中已经得到越来越广泛地应用。堆肥系统中，微生物降解木质素的代谢过程由一系列酶共同完成，而锰过氧化物酶(MnP)和纤维二糖脱氢酶(CDH)在其中起了关键性作用。用DNA生物传感器检测其编码基因，能更好地了解这两种酶的协同作用。本研究拟制备固定化核酸探针传感器用于检测黄孢原毛平革菌锰过氧化物酶和纤维二糖脱氢酶的编码基因，探讨DNA传感器用于同时检测两种堆肥高效降解菌产酶基因的可行性。同时运用PCR．DGGE技术对堆肥中微生物群落多样性进行了研究。首先研究了DNA生物传感器单独检测黄孢原毛

2、平革菌锰过氧化物酶编码基因。利用自组装单分子膜技术，将毓基修饰的探针固定在金电极表面。采用交流阻抗法和循环伏安法，表征疏基修饰的ssDNA在金电极上的固定及杂交过程。再用计时电流法扫描，得出电化学信号与目标链浓度问的线性关系。研究了目标序列的线性检测范围、特异性以及各种影响因素。该传感器的线性范围为4×10‘7～l×1002M，检测限为1．0×1002M。接着，将巯基修饰的两种木质素降解酶一锰过氧化物酶、纤维二糖脱氢酶的寡核苷酸探针通过自组装的方法固定在金电极表面。通过靶基因序列与其互补链之间夹心式杂交后序列的高度选择性和极强的

3、分子识别能力，将辣根过氧化物酶、漆酶分别标记在不同的酶基因上，利用酶标的不同催化反应将杂交信号放大，实现对两种木质素降解酶编码基因同时进行电化学检测。锰过氧化物酶、纤维二糖脱氢酶靶基因序列的浓度分别在1．O×lO‘11～4．O×10。8M和1．O×lO’10～4．0×lO墙M范围时，其浓度的对数值和两种酶催化反应产生的电流变化值呈线性相关关系，相关系数分别为0．9884和0．988l，检出限分别为1．0×10—1M和5．Oxl001M。同一目标链浓度均平行测定三次，其RSD分别为4．30％和3．52％。该传感器特异性强，灵敏度高

4、，重复性和稳定性也较好。最后，通过PCR．DGGE(变性梯度凝胶电泳)方法分析了堆肥过程中微生物群落结构多样性及其变化规律。测定了堆肥过程中pH、温度、有机质含量、C／N的变化，4个指标均反映出这是一个典型的堆肥过程。PCR．DGGE图谱显示：不同时I、HJ堆肥样的DGGE图谱有着明显的差异性，温度对堆肥过程中微生物种群具有明显的筛选作用。关键词：基因传感器；木质紊降解：锰过氧化物酶；纤维二糖脱氢酶；群落多样性桀㈥f擘感器拎测小质素降解酶早洲及堆肥群萍多样十牛研究AbstractCompostingtechnologyisapp

5、liedtodisposalofthemunicipalsolidwasteincreasingly．Themetabolicprocessduringmicrobialdegradationofligniniscompletedtogetherbyaseriesofenzymesinthecompostsystem，inwhichmanganeseperoxidaseandcellobiosedehydrogenaseplaythekeyrole．Itisbettertoknowthesynergybetweenthetwoe

6、nzymesbyusingDNAbiosensor．ThisstudyWastoprepareDNAprobesimmobilizedbiosensorfordetectingmanganeseperoxidaseandcellobiosedehydrogenaseencodinggenesfromPhanerochaetechrysosporium．ThefeasibilityforsimultaneousdetectionoftwogenesWasdiscussedandpolymerasechainreaction-den

7、aturinggradientgelelectrophoresis(PCR—DGGE)analysisWasusedtostudythecompostingmicrobialcommunitydiversity．First，thedetectionofmanganeseperoxidaseencodinggenesfromPhanerochaetechrysosporiumWasstudied．Mercapto-modifiedprobeself-assembledonthegoldelectrodesurfaceandthep

8、rocessofimmobilizationandhybridizationofssDNAwerecharacterizedbyimpedancespectroscopyandcyclicvoltammetry．Thelinearrelationshipofel