南林895杨转抗旱耐盐基因研究

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1、摘要杨树在我国分布广泛，生长较快，适应性强，繁殖容易，并且其基因组小，在传统和分子操作上要比大多数树种简单，是林木育种研究的模式树种。DI疆B1C转录因子(DehydrationResponsiveElementBinding)是一类与逆境胁迫相关的转录因子，它能够识别与干旱、高盐及低温等胁迫应答相关基因启动子区域中的DRE(dehydrationresponsiveelement)顺式作用元件并与之结合，从而启动下游抗逆基因的表达，提高植物的抗逆性。开展杨树抗干旱耐盐碱转DREBlC基因研究对于我国干旱、盐碱地区的造林绿化、扩大杨树的栽培区、改善生态环境等方面均具有重要的现

2、实意义。本研究以南林895杨(美洲黑杨1-69×欧美杨I．45杂种Fl中选育出的优良无性系)为受体材料，采用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法转化抗逆转录因子DREBlC基因；同时，同源克隆拟南芥逆境胁迫诱导性启动子rd29A，构建植物表达载体pDR2．rd29A并转化杨树，主要试验结果如下：1．根据NCBI上报道的rd29A启动予序列设计引物，从拟南芥中同源克隆rd29A启动子，构建植物表达载体pBrd，并转化烟草进行活性验证。转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明，在低温、干旱及高盐等胁迫诱导下，rd29A启动子可增强GUS基因表

3、达，表明rd29A启动子可应用于植物抗逆基因工程研究。2．构建由逆境胁迫诱导型启动子rd29A启动目的基因DREBlC表达的植物表达载体pDR2．rd29A，双酶切鉴定结果表明，rd29A启动子成功地插入载体pDR2中；采用液氮冻融法将载体pDR2-rd29A导入农杆菌LB4404中，菌液PCR扩增出目的条带，证明该植物表达载体pDR2-rd29A已转入农杆菌LB4404中。3．进行选择性抗生素潮霉素的敏感性试验，分别对叶片分化及生根本底浓度进行敏感性试验，结果表明，3mgrL潮霉素(Hyg)可作为芽再生的临界筛选浓度：1．5mg／LHyg可作为芽生根的筛选浓度。4．用农杆菌

4、介导法将由两种启动子(组成型启动子35S和逆境胁迫诱导型启动子rd29A)启动的目的基因DREBIC导入南林895杨中。经过潮霉素筛选，得到潮霉素抗性的转35S：：DREBlC基因的杨树80株，转碰9A：：DREBlC基因的杨树40株。抗性植株的PCR与实时定量PCR分子检测结果，转35S：：DREBlC基因杨树有30株呈阳性，转rd29A：：DREBlC基因杨树有15株呈阳性，初步证明外源目的基因DREBlC已经整合到南林895杨基因组中。5．对转基因杨树植株的形态学观察表明，两类转基因植株形态正常，没有发生畸形突变，即没有引起植株的矮化现象。在干旱和高盐胁迫下，两类转基因

5、植株均能正常生长，其生长势优于未转基因植株。这表明两类转基因植株的抗旱耐盐能力均强于对照植株。关键词：南林895杨；RD29A启动子；DREBlC基因；根癌农杆菌：遗传转化；抗逆性TransformationofDroughtandSaltResistantGeneinPopulusxeuramericanaCV．‘Nanlin895’AbstractPoplarhasbeenrecognizedasamodeltreespeciesbyForestGenetistsduetoitsfastgrowth,easypropagation,wideadaptation,andit

6、ssmallgenomesize．DREBlCtranscriptionfactor(DehydrationResponsiveElementBinding)iscorrelatedwithstressanditcandistinguishDRE(dehydrationresponsiveelement)cis·actingelementinthepromoterregionofstressresponsegenesaboutdrought，highsalt,lowtemperatureandSOon．Moreover,itcartregulatedownstreamresi

7、stancegene’SexpressionincombinationwithDREcis—actingelement,sequentiallyenhancestressresistanceofplant．Inordertobroadencultivationofpoplar,especiallyindroughtandsaltarea,itisveryimportanttodeveloptransgenicpolparresistanttodmuginandsalI．Inthisstudy,leafd