南林895杨抗虫转基因研究

《南林895杨抗虫转基因研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要本研究以南林895杨叶片为材料，在建立高效组培再生体系的基础上，采用根癌农杆菌介导法，开展了抗虫基因苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因的遗传转化研究，取得的主要进展如下：1．高频组培再生体系的建立：通过对基本培养基的筛选，激素种类和浓度的调整，培养条件的选择等，获得了高效分化再生培养基：勾MS+6一BA0．5mg／L+TDZ0．002mg／L，分化率为100％，每个叶盘产生大量的丛生芽，为遗传转化工作提供了坚实的基础；2．遗传转化中选择压的确定：所用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶(Npt11)基因，在遗传转

2、化中采用卡那霉素作为筛选转化植株的选择剂。经过对比试验，结果表明采用Kan20mg／L作为筛选时的选择压。3．遗传转化体系的优化：研究了影响根癌农杆菌转化的各个因素，得出最优转化条件是：预培养3d，菌液浓度OD6001．O～1．3左右，侵染时间20min，共培培养基中加AS120～200mg／L，pH调为5．8，不去除CoCl2·6H20，共培养温度设为28℃，共培养4d。在此优化的转化体系下，美洲黑杨的转化率由4．5％增加到28．7％，提高了6倍：4．转抗虫基因植株的获得和分子检测：在经卡那霉索严格筛选获得的22株转Bt基因和5株转CpTI基因的再生

3、植株进行PCR检测，结果转Bt基因的K．anr再生植株DNA样品中有18株呈阳性，转CpTI基因的Kanr再生植株DNA样品中有l株呈阳性，试验结果初步证明目的基因已被导入到美洲黑杨杂种基因组中：5．转基因杨树的移栽：选取培养一个月的试管苗，移栽前炼苗3～4d，移栽的8株转Bt基因、l株转CpTI基因和1株对照植株全部成活，移栽成活率100％。关键词：南林895杨，根癌农杆菌，遗传转化，Bt基因，CpTI基因AbstractInthisstudy,IeafdiscofPopulusxeuramericanaCV．'Nanlin895’wasusedas

4、experimentmaterial，onthebasisoftheestablishmentofhighfrequencyregenerationsystem，adaptingtoAgT'obacwrium—mediatedtointroduceseparatelytwoinsect-resistancegenesofBacillusthudgiensis∞f)geneandcowpeatrypsininhibitorfC扫硒gene．Themainconclusionofthisexperimentwasasfollowing：1．Establis

5、hmentofhi曲frequencyregenerationsystem：throwIghthescreeningtothebasicculturemedium，theadjustmentofhormonekindandproportion，choiceofthecukurecondition，theoptimalmediumfordi行brentiationwasMS+6．BA0．5mg／L+TDZ0．002mg／L，obtain100％differentiationfrequency,eachIeafdiSCproducedalargenumbe

6、rofmultiplicationofshoot，thisofferedsolidfoundationforgenetictransformation．2．Determinationofselectivepressureoftransformation：theselectablemarkergeneofBtandCprlwerebothNpTII，SOadoptingkanamycinasselectiveagentintransformation．ThroughcontraStexperiment。itiS20mg／Lkanamycinasselec

7、tivepressure．3．Establishmentoftheefficientsystemoftransformation：westudiedseveralfactorsaffectingAgrobacterium．mediatedtransformation，drawingthebesttransformcondition：pre—culturetimewere3days，bacterialconcentrationOD6001．0H1．3，infectiontimewere20minute，addedAS120—200mgmincocultu

8、remedium，coculturemediumadiustedpH5．8anddidnotr