转化生长因子β1在动脉内膜损伤后狭窄形成中的作用

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1、南京医科大学硕士学位论文转化生长因子β1在动脉内膜损伤后狭窄形成中的作用姓名：王润洁申请学位级别：硕士专业：病理学指导教师：冷静;范乐明20030420南京医科大学硕士学位论文转化生长因子B．在动脉内膜损伤后狭窄形成中的作用摘要研究背景冠心病是当前危害人类健康的最主要疾病之一。随着治疗水平的不断提高，冠心病的介入性治疗一经皮腔内冠状动脉成型术(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)可以明显减轻病变血管的狭窄状况，改善缺血心肌的血供，已经成为与药物治疗、手术治

2、疗同等重要的第三种治疗方法。PTCA的成功率可达95％v；Z上，但约有35％～50％的病人在术后半年内出现原发部位的再狭窄(restenosis，RS)，严重影响了远期疗效。目前的研究表明，再狭窄的发生机制中一个最重要的环节是血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)在多种细胞因子的刺激下发生表型的改变、迁移、增殖并产生大量的细胞外基质。转化生长因子13(transforminggrowthfactorl3，TGF一8)是一种相对分子量为2．5×104的二聚体多肽，具有调节细胞生长和

3、分化的功能。研究表明TGF．13可以调节成纤维细胞和损伤血管VSMC增生，增加细胞间质的合成和分泌，增加细胞外基质和细胞骨架的结今f本课题以TGF．p。为对象，研究其在ab_管损伤后狭窄过程中对胶原积聚、VSMC增殖、整合素一粘着斑激酶(FAK)蛋白表达的作用，以期对血管再狭窄的机理和防治进行进一步的探讨。?研究目的1．在已建立的内膜损伤后血管狭窄动物模型上，观察损伤后内膜增殖灶中TGF．8l的表达及与I、IIl型胶原、基质金属蛋白酶一9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的关系。观察T

4、GF-Dl对体外培养的大鼠VSMC分泌胶原及MMPs活性的影响。以探讨TGF．pI对细胞外基质积聚的作用。2．观察不同浓度的TGF—pl刺激对体外培养的大鼠VSMC的增殖的影响。3．探讨TGF．Bl对整合素一FAK表达的作用。研究方法l南京医科大学硕士学位论文1．在已建立的腹主动脉内膜损伤后血管狭窄的动物模型上(新西兰大白兔21只，随机分为对照组和5组试验组，每组各3只，分别于腹一髂动脉联合损伤术术后l周、2周、4周、3个月及4个月处死)应用分子及免疫病理学的方法，用DIG标记的TGF．13I、1型胶原及MMP．9寡

5、核苷酸探针、III型胶原抗体，进行原位杂交和免疫组织化学实验，对TGF．13l、I、III型胶原、MMP．9的动态变化及相互关系进行探讨。2．进-45-大鼠胸主动脉VSMC原代培养，并用免疫组织化学的方法通过抗鼠平滑肌细胞肌动蛋白(myosin)染色实验来鉴定培养细胞的性质。取4～6代平滑肌细胞进行TGF一13l刺激，浓度为lng／ml、5ng／ml、10ng／ml，作用时间为24小时，应用3H一脯氨酸(3H．Proline，3H．PRL)掺入法检测VSMC分泌胶原的变化，并设立未加任何刺激的正常对照。同样刺激后，裂

6、解细胞并收集细胞上清，用明胶酶谱法分别测定MMPs活性的改变。3．取第4～6代VSMC行TGF．Bl刺激，浓度为1ng／ml、5ng／ml、10ng／ml作用时间为6小时，应用流式细胞仪测定并分析细胞DNA含量，用PCNA免疫组织化学法和图像分析，观察TGF．B1对VSMC生长、增殖的影响。4．在兔腹主动脉内膜损伤后血管狭窄的动物模型上用原位杂交的方法检测FAKmRNA的表达。同上经TGF．6I刺激6小时后，进行细胞免疫组织化学实验，检测整合素吣FAK蛋白的表达变化，从而探讨TGF—Bl与整合素一FAK蛋白表达的关系

7、。5．原位杂交和免疫组化的结果以NYD．1000型计算机图像分析系统分析。数据用SPSS软件统计分析。研究结果1．在已建立的兔腹主动脉内膜损伤后血管狭窄的动物模型上，观察了内膜损伤后4个月内狭窄处新生内膜中TGF．131、I、III型胶原、MMP．9的动态变化。结果显示：内膜损伤后2周1、GF．BI和I型胶原的表达开始增多，并逐渐增加至术后4个月。TGF．13l表达阳性细胞分布在增殖内膜及靠近内1。2南京医科大学硕士学位论支膜的中膜，I型胶原阳性颗粒在第2周前主要位于增生细胞的胞浆中，2周后主要位于间质。正常血管lI

8、I型胶原mRNA的表达极低，损伤后l周迅速增加，至4周达到峰值。MMP．9的表达在术后2～4周时达到高峰，至4个月表达有所下降，中期主要分布在新生内膜及中膜近外膜处，晚期(3～4个月)主要位于弹力板周围。2．进行了SD大鼠胸主动脉VSMC的原代培养，并对培养细胞的来源进行了免疫组织化学鉴定，证实为平滑肌细胞。通过3H．PRL掺入法检测经不同浓度